AT NHS酯很容易與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)。我們擁有提供各種高質(zhì)量的胺反應(yīng)染料，用于標(biāo)記蛋白質(zhì)和其他含胺底物。染料的光譜范圍從紫外350nm到近紅外750nm。常用的胺反應(yīng)試劑是N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯。NHS酯很容易與含有氨基的化合物反應(yīng)，在染料和蛋白質(zhì)之間形成化學(xué)穩(wěn)定的酰胺鍵。然而，氨基必須是非質(zhì)子化的才能具有活性。因此，必須將溶液的pH調(diào)節(jié)到非常高的水平，以獲得高濃度的未質(zhì)子化氨基。另一方面，NHSesterscan還與溶液中的氫氧根離子反應(yīng)，導(dǎo)致形成不再具有活性的“游離”染料。由于不可避免的水解速率會(huì)隨著氫氧根離子的濃度而增加，因此pH值應(yīng)保持在較低的范圍內(nèi)。pH 8.3的緩沖溶液已被發(fā)現(xiàn)是這些沖突需求之間的一個(gè)很好的折衷方案

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艾美捷AT 550?琥珀酰亞胺酯：

Cat#：B-CHM502/B-CHM503/B-CHM504/B-CHM505

規(guī)格：1 mg

儲(chǔ)存：儲(chǔ)存溫度為-20°C，避光保存。

形態(tài)：結(jié)晶固體

儲(chǔ)存條件：儲(chǔ)存溫度為-20°C，避光。

穩(wěn)定性：在適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存條件下穩(wěn)定至少12個(gè)月

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AT 550?琥珀酰亞胺酯規(guī)格：

MW：包括抗衡離子的染料的分子量，單位為g/mol；M+：染料陽離子的分子量（HPLC_MS乙腈/水0.1vol-%三氟乙酸）；?m： 與AT染料NHS酯結(jié)合時(shí)分子質(zhì)量的增加；?q： 與AT染料NHS酯結(jié)合的電荷增加；εmax：最長(zhǎng)波長(zhǎng)吸收最大值下的摩爾十年消光系數(shù)M-1cm-1；CF260=ε260ε/最大值；CF280=ε280ε/最大值

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用AT NHS標(biāo)記蛋白質(zhì)的建議方案：

AT NHS酯很容易與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)。NHS酯結(jié)合的最佳pH范圍是pH

8.0-9.0。在這個(gè)pH范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的氨基，特別是賴氨酸的氨基，被充分去質(zhì)子化以進(jìn)行快速偶聯(lián)。

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所需材料：

溶液A:PBS緩沖液（磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7.4）：將8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4-2H2O和0.24 g KH2PO4溶解在1L蒸餾水中。

溶液B:0.2 M碳酸氫鈉溶液，用2 M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至9.0。

溶液C：將20份溶液A與1份溶液B混合，得到pH為8.3的標(biāo)記緩沖液。將此溶液儲(chǔ)存在密封瓶中，以保持長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

溶液D：將1.0 mg NHS酯溶解在50-200 ul無水無胺二甲基亞砜（DMSO）中，或

乙腈。

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染料原液的制備與處理

在測(cè)定染料儲(chǔ)備溶液的濃度時(shí)，我們建議取等量的樣品，用酸化乙醇（0.1體積%三氟乙酸）稀釋，以避免染料聚集，在某些情況下（AT 565和AT 590），避免無色內(nèi)酯的形成。根據(jù)溶劑的質(zhì)量，這種儲(chǔ)備溶液在室溫下不穩(wěn)定，必須在20℃下避光保存。

活性分子可能發(fā)生水解并失去活性。我們建議盡可能在開始標(biāo)記反應(yīng)之前立即新鮮制備染料原液。應(yīng)當(dāng)注意的是，諸如DMSO或DMF的溶劑應(yīng)當(dāng)不含親核性和/或堿性雜質(zhì)。這些化合物可以與NHS酯官能團(tuán)反應(yīng)，降低偶聯(lián)效率。

綴合物制備

蛋白質(zhì)溶液不能含有任何含胺物質(zhì)，如Tris、游離氨基酸或銨離子。溶解在胺緩沖液中的抗體應(yīng)針對(duì)溶液A進(jìn)行透析，并且通過溶液C中描述的步驟實(shí)現(xiàn)8.3的期望偶聯(lián)pH。

1、為了實(shí)現(xiàn)2-3的平均標(biāo)記度（DOL）（染料與蛋白質(zhì)的比例），在輕輕搖動(dòng)的同時(shí)，向蛋白質(zhì)溶液中輕輕添加三倍摩爾過量的活性染料（溶液D）。由于蛋白質(zhì)和標(biāo)記試劑之間的反應(yīng)性不同，可能會(huì)發(fā)生變化。在反應(yīng)過程中有必要優(yōu)化染料與蛋白質(zhì)的比例，以獲得所需的DOL。必須使用更高比例的NHS酯和蛋白質(zhì)來提高標(biāo)記效率，反之亦然。

2、將反應(yīng)混合物在室溫下避光培養(yǎng)1小時(shí)。對(duì)于AT565-NHS和AT590-NHS，我們建議在環(huán)境溫度下培養(yǎng)18小時(shí)以完成反應(yīng)。