蛋白質(zhì)印跡（或免疫印跡）分析程序可從復(fù)雜混合物（例如細(xì)胞或組織提取物）中鑒定和定量單個(gè)蛋白質(zhì)。 通常，該技術(shù)涉及在變性條件下通過(guò)凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，從凝膠上將蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移或“印跡”到固體支持膜，用對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)具有特異性的抗體探測(cè)該膜，然后觀察結(jié)合的抗體 使用標(biāo)記的第二免疫試劑。 ??因此，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)是在不同條件下對(duì)健康和疾病中的組織或培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的必不可少的檢測(cè)方法。

W?B實(shí)驗(yàn)步驟:

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一、樣品的裂解
◇制備出細(xì)胞培養(yǎng)物的裂解物
1.將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰上，用低溫的PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌。
2.吸出PBS緩沖液后再加入介于0℃的細(xì)胞裂解緩沖液（每107細(xì)胞/100mm；培養(yǎng)皿/150cm2?培養(yǎng)瓶中加入1ml；每5×106?細(xì)胞/60mm培養(yǎng)皿/75cm2?培養(yǎng)瓶中加入0.5ml）。
3.用預(yù)冷后的細(xì)胞刮棒將貼壁細(xì)胞刮下，然后將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的微量離心管中后；
4.在4℃溫度條件下下持續(xù)攪拌約30分鐘左右；
5.在4℃預(yù)冷后的離心機(jī)中以16000×g的轉(zhuǎn)速離心大約20分鐘左右；
6.小心地將離心管從離心機(jī)中取出，防止在冰上，然后將上清液轉(zhuǎn)移到放置冰上的新離心管中后，棄去沉淀。
◇制備組織裂解物
1.在0℃條件下，用干凈的工具切取目標(biāo)組織（注意：該過(guò)程需要快速完成），以確保樣品不會(huì)被蛋白酶降解；
2.將組織置于圓底的微量離心管中，然后浸入液氮中進(jìn)行速凍，將樣品保存在-80℃下以備后續(xù)試驗(yàn)繼續(xù)使用，也可放置冰塊上直接進(jìn)行勻漿。取約5mg的組織，然后向離心管中快速加入約300μL的裂解緩沖液，選用電動(dòng)勻漿器進(jìn)行勻漿，另外的300μL裂解緩沖液沖對(duì)刀片進(jìn)行兩次清洗，然后在4℃下持續(xù)攪拌（一般實(shí)驗(yàn)選用回旋振蕩器上）2小時(shí)。
3.4℃溫度條件下，在微型離心機(jī)中以16000×g的離心速度離心約20分鐘，然后輕輕地從離心機(jī)中取出離心管，置于冰塊上。將上清液轉(zhuǎn)移放置在冰上的新離心管中后棄去沉淀物。

二、樣品制備
1.取約50μL的裂解物，進(jìn)行蛋白分析，以確定每種細(xì)胞裂解物的蛋白濃度。
2.向剩余體積的細(xì)胞裂解物中加入等體積的2×Laemmli樣品緩沖液。一般推薦采用以下方法對(duì)樣品進(jìn)行還原和使樣品變性，除非在線抗體數(shù)據(jù)表指明應(yīng)使用非還原和非變性條件。
3.還原和變性：在100℃溫度條件下，將樣品緩沖液中的每種細(xì)胞裂解物煮沸5分鐘左右，之后進(jìn)行分裝。在-20°C溫度下保存裂解物，注意：分裝細(xì)胞裂解物(50-100μL)，避免反復(fù)凍融循環(huán)。
4.在37℃溫度條件下，對(duì)裝有細(xì)胞裂解為的離心管進(jìn)行解凍，在微量離心機(jī)中以16,000×g的離心率，離心約5分鐘。

三、上樣和電泳
1.將等量的蛋白質(zhì)和分子量標(biāo)準(zhǔn)上樣到SDS-PAGE凝膠孔中。來(lái)源于細(xì)胞裂解物或組織勻漿的總蛋白的上樣量為20-30μg，純化蛋白的上樣量為10-100ng。
2.在100V下電泳1至2小時(shí)?？赡苄枰獙?duì)時(shí)間和電壓進(jìn)行一些優(yōu)化。我們推薦按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行操作。應(yīng)使用還原型凝膠，除非抗體數(shù)據(jù)表中推薦使用非還原性條件。
凝膠百分比取決于蛋白質(zhì)的大?。?～40kDa12～45kDa10～70kDa15～100kDa25～200kDa20%15%12.5%10%8%

四、把蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜

? ? ? ?膜可以是硝酸纖維素或PVDF，兩者各具優(yōu)點(diǎn)。用甲醇活化PVDF約1分鐘，并在制備堆疊體之前用轉(zhuǎn)膜緩沖液對(duì)PVDF進(jìn)行沖洗。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要對(duì)時(shí)間和電壓進(jìn)行優(yōu)化（依據(jù)設(shè)備）。在封閉步驟之前采用麗春紅染色法檢查轉(zhuǎn)膜，所得膜可用于抗體染色。

五、抗體的染色
1.用5%封閉溶液在室溫條件下封閉膜約1小時(shí)，或在4℃條件下封閉約24小時(shí)；
2.用適當(dāng)稀釋度的一抗在5%或2%封閉溶液中4℃約12小時(shí)孵育膜，或在室溫條件下孵育約2小時(shí)；
3.用TBST洗滌膜3次，每次大約5分鐘；
4.用推薦稀釋度的標(biāo)記二抗，在含5%封閉緩沖液的TBST中室溫條件下孵育膜1小時(shí)；
5.使用TBST緩沖液沖洗膜3次，每次大約5分鐘，然后用TBS緩沖液進(jìn)行沖洗；
6.要產(chǎn)生信號(hào)，請(qǐng)遵循試劑盒廠商的實(shí)驗(yàn)方法；
7.去除多余的試劑，并采用透明塑料膜覆蓋膜；
8.利用暗室顯影技術(shù)，采集化學(xué)發(fā)光圖像，也可以利用常規(guī)圖像掃描法采集比色檢測(cè)的圖像。