Reads mapping通常是深度測(cè)序數(shù)據(jù)分析的第一步?；谏疃葴y(cè)序技術(shù)，RNA-Seq產(chǎn)生的reads在長(zhǎng)度、數(shù)量、質(zhì)量等方面與基因組重測(cè)序產(chǎn)生的DNA reads具有相似的特性。例如，它們都存在長(zhǎng)度短、數(shù)量多、質(zhì)量參差不齊、錯(cuò)誤率高等問(wèn)題。

然而，RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)也有其自身的特點(diǎn)，因?yàn)樗鼇?lái)自RNA轉(zhuǎn)錄本。具體來(lái)說(shuō)，在從DNA到mRNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，內(nèi)含子被切掉，外顯子在剪接位點(diǎn)連接在一起。對(duì)于跨剪接位點(diǎn)的reads，也稱為junction reads，如果你不從中間打斷它們，它們將無(wú)法準(zhǔn)確映射到基因組。

這些連接點(diǎn)讀數(shù)是確定剪接位點(diǎn)的直接證據(jù)。它們對(duì)于正確重建轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。例如，在下圖中，跨外顯子1和外顯子3的連接讀數(shù)直接支持外顯子1和外顯子3直接連接的轉(zhuǎn)錄本的存在，中間不包含外顯子2。同樣，在下圖中，

兩種junction reads分別支持外顯子1與外顯子3直接連接的轉(zhuǎn)錄本和外顯子3與外顯子5直接連接的轉(zhuǎn)錄本的存在。因此，我們的映射算法需要考慮連接位點(diǎn)和內(nèi)含子，以便正確處理這些連接讀取。

具體來(lái)說(shuō)，目前針對(duì)這個(gè)問(wèn)題主要有兩種策略。一個(gè)是加入外顯子策略（join exon）。該策略的第一步是根據(jù)已知轉(zhuǎn)錄本中的所有外顯子構(gòu)建所有可能的連接。需要注意的是，這個(gè)庫(kù)中的結(jié)點(diǎn)可能是未知的，但包括了所有可能的組合。例如，4個(gè)外顯子對(duì)應(yīng)六種組合。之后，進(jìn)行通常的映射，其中非連接讀取以類似于那些DNA讀取的未拼接方式映射到基因組。對(duì)于那些不能直接映射的連接讀取，我們將它們與第一步中構(gòu)建的連接庫(kù)對(duì)齊。事實(shí)上，join exon策略可以作為之前DNA reads mapping算法的補(bǔ)丁。該策略可以通過(guò)構(gòu)建所有可能的連接庫(kù)來(lái)發(fā)現(xiàn)新的剪接異構(gòu)體。

然而，它對(duì)未知外顯子無(wú)能為力。我們可以轉(zhuǎn)向拆分讀?。╯plit reads）策略來(lái)處理這個(gè)問(wèn)題。與之前的DNA reads映射算法類似，split reads策略也將首先以未拼接的方式將非連接reads映射到基因組。對(duì)于那些不能直接映射的junction reads，它們將被切成多個(gè)長(zhǎng)度為k的種子來(lái)重試映射，這類似于BLAST方法。換句話說(shuō)，此策略試圖以更細(xì)的粒度查找連接站點(diǎn)。最后，將彼此靠近的映射種子組合起來(lái)以獲得最終的整體讀取對(duì)齊。與之前的Join exon策略相比，split reads策略速度較慢，因?yàn)樗枰成浔萺eads更短的種子。然而，這種策略不依賴于先前的外顯子注釋，并且可以發(fā)現(xiàn)新的外顯子甚至新基因。

事實(shí)上，目前常見(jiàn)的RNA-Seq工具通常將這兩種策略結(jié)合在一起，以平衡靈敏度和速度。例如，約翰霍普金斯大學(xué)、伯克利大學(xué)和哈佛大學(xué)共同開(kāi)發(fā)的TopHat2工具試圖首先通過(guò)Join?exon策略快速識(shí)別已知的連接位點(diǎn)，然后使用spilt reads策略發(fā)現(xiàn)新的連接點(diǎn)。TopHat2的一個(gè)值得注意的特點(diǎn)是它針對(duì)不同的策略使用不同的索引，這可以進(jìn)一步提高映射速度。

映射只是RNA-Seq數(shù)據(jù)分析的第一步。我們?nèi)匀恍枰獙⑦@些reads組裝成轉(zhuǎn)錄本，并估計(jì)它們的表達(dá)水平。在正確映射所有讀?。òㄟB接讀?。┖?，我們可以將轉(zhuǎn)錄本組裝問(wèn)題解釋為有向圖上的遍歷問(wèn)題。

我們可以使用圖論中的尋路算法在不同邊被分配不同權(quán)重的約束下找到一條或多條最優(yōu)路徑及其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄序列。我們將通過(guò)常用工具Cufflinks來(lái)說(shuō)明基本思想。

Cufflinks是一種基于RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝和表達(dá)分析的工具。假設(shè)我們只觀察reads而不知道有這三種轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)。首先，Cufflinks會(huì)嘗試找出不可能出現(xiàn)在同一筆錄中的片段。例如，此處的黃色和藍(lán)色片段不可能存在于同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本中。原因是如果它們存在于同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本中，黃色的會(huì)在藍(lán)色的這個(gè)位置中斷而不是跳過(guò)它。同樣，紅色、黃色和藍(lán)色片段都是相互排斥的，而兩個(gè)相同顏色的片段是相容的。我們可以將每個(gè)片段視為一個(gè)節(jié)點(diǎn)，并將所有彼此相容的片段連接起來(lái)，從而得到重疊圖。在簡(jiǎn)約原則的指導(dǎo)下，Cufflinks將嘗試找出“最小成本路徑覆蓋”作為最佳路徑，該路徑具有最少數(shù)量的路徑，可以覆蓋所有讀取并且沒(méi)有重疊。這樣就獲得了三個(gè)轉(zhuǎn)錄本的最終集合。

原則上，一旦轉(zhuǎn)錄本組裝正確完成并且這些外顯子的表達(dá)水平已正確歸一化，轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平就可以直接從外顯子的表達(dá)水平推斷出來(lái)，如上一單元所述。例如，假設(shè)我們可以從基因組上的三個(gè)外顯子推斷出兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本t1和t2。同時(shí)，假設(shè)可以確定每個(gè)外顯子的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平：e1=20、e2=40和e3=60。然后我們可以直接從轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)推斷出轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平和外顯子表達(dá)水平之間的關(guān)系。例如，外顯子1僅存在于轉(zhuǎn)錄本1中，因此其所有表達(dá)均由轉(zhuǎn)錄本1提供。類似地，外顯子3同時(shí)存在于轉(zhuǎn)錄本1和轉(zhuǎn)錄本2中，因此其表達(dá)由兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本提供。因此，我們認(rèn)為外顯子1的表達(dá)水平就是轉(zhuǎn)錄本1的表達(dá)水平，而外顯子3的表達(dá)水平是轉(zhuǎn)錄本1和轉(zhuǎn)錄本2的表達(dá)水平之和。我們可以推斷出轉(zhuǎn)錄本1和轉(zhuǎn)錄本2的表達(dá)水平，分別是20和40。

當(dāng)然，這個(gè)問(wèn)題在實(shí)踐中變得更加復(fù)雜，因?yàn)槲覀兛紤]到轉(zhuǎn)錄本組裝算法決定了reads分布的性質(zhì)這一事實(shí)。例如，在Cufflinks中，reads的分布與其他因素有關(guān)，例如長(zhǎng)度分布。事實(shí)上，轉(zhuǎn)錄本組裝和表達(dá)水平估計(jì)通常由EM和其他迭代算法完成，以進(jìn)一步準(zhǔn)確估計(jì)表達(dá)水平。