在藥物發(fā)現(xiàn)中，對新藥的篩選、評估、驗證等過程極其漫長和成本高昂，通?？缍仁畮啄甑臅r間，花費超過10億美元，且最終只有一小部分候選藥物能夠真正進入市場。具有高風險、高投入、超長周期的特點。因此挖掘新技術(shù)攻克藥物發(fā)現(xiàn)過程中的難題是加快藥物開發(fā)進程、降低藥物開發(fā)風險的關(guān)鍵。

1.?使用CRISPR技術(shù)開發(fā)新療法

藥物發(fā)現(xiàn)的臨床前階段很大程度上依賴于對基因組的編輯能力。通過改變基因的序列或改變基因的表達水平，科學家們可以開發(fā)出一系列的檢測方法來發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的靶點并測試其治療效果。然而，快速、準確、經(jīng)濟有效的基因組編輯能力往往受到技術(shù)的限制。例如，目前廣泛使用的RNA干擾(RNAi)篩選，往往只是部分沉默基因表達，并伴有高頻率的脫靶效應。?CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，大大改善了這一現(xiàn)狀。通過設計一個短的gRNA序列，科學家?guī)缀蹩梢允褂肅as9對任何基因或位點進行切割，誘導細胞修復，促進基因敲除、敲入或定點突變。由于這些基因修飾是內(nèi)源性的，科學家可以在自然條件下研究相關(guān)基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平的后續(xù)變化。?

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CRISPRa（基因激活）和CRISPRi（基因抑制）的出現(xiàn)，也增加了CRISPR技術(shù)的易用性和通用性，它在克服藥物發(fā)現(xiàn)的許多技術(shù)挑戰(zhàn)方面顯示出更大潛力。在這里，我們總結(jié)了CRISPR技術(shù)在推進臨床前藥物開發(fā)的一些應用。

2.?藥物發(fā)現(xiàn)流程

藥物研發(fā)過程通常從基礎科學研究開始，在新療法獲準臨床使用之前，要經(jīng)過許多步驟。雖然每個制藥公司發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新藥的方法不同，但大多數(shù)臨床前過程的主要步驟是共同的，即靶點發(fā)現(xiàn)和驗證、高通量藥物篩選、hit驗證和先導藥物優(yōu)化。

• 01 關(guān)鍵靶點發(fā)現(xiàn)和驗證

藥物發(fā)現(xiàn)過程始于疾病相關(guān)的作用靶點(DNA、RNA或蛋白質(zhì))的發(fā)現(xiàn)。通常新靶點都是通過科學研究中的新發(fā)現(xiàn)獲得。
?基于CRISPR技術(shù)的高通量篩選系統(tǒng)可以用于大規(guī)模地敲除（CRISPR-KO）、抑制（CRISPRi）或激活（CRISPRa）大量候選基因。通過觀察疾病表型的惡化或是緩解，可以找到潛在的藥物作用靶點。?一旦確定了一個潛在的藥物作用靶點，需要進一步收集體外實驗和體內(nèi)實驗的功能驗證數(shù)據(jù)。此階段可以通過CRISPR技術(shù)構(gòu)建基因敲除細胞系模型和基因激活（過表達）細胞系模型來加速這一進程。如果一個靶點和疾病之間的因果關(guān)系已經(jīng)確定，并且該靶點具有藥物開發(fā)潛能，那么接下來就可以啟動高通量的化合物篩選實驗，尋找潛在的治療候選藥物。

• 02 高通量化合物篩選
  

在靶點發(fā)現(xiàn)和驗證之后，下一步就是高通量篩選數(shù)萬個化合物。其內(nèi)容包含靶點-化合物互作、結(jié)合親和力等生化分析以及基于細胞系篩選的功能關(guān)聯(lián)性分析。?通過CRISPR技術(shù)可以更準確地構(gòu)建與疾病相關(guān)的突變細胞株，提高了基于細胞系篩選的效率。例如，使用CRISPR技術(shù)可以同時誘導多個位點定點突變，可以更好地模擬疾病基因型。通過這些細胞模型，可以在藥物發(fā)現(xiàn)過程的早期準確地排除無效化合物并識別出有效的化合物，節(jié)省時間，降低成本。通過這一輪篩選的化合物分子將在下一階段中接受更嚴格的測試驗證。?

• 03 候選化合物驗證
  

經(jīng)過上一輪篩選得到的化合物將進行細胞系模型驗證。通過CRISPR技術(shù)可以加速構(gòu)建疾病相關(guān)細胞系模型，通過這些精確的細胞系模型可以加速臨床前研究進程。
?除了永生細胞系外，科學家還可以生產(chǎn)具有相關(guān)遺傳背景的原代細胞、干細胞或類器官。例如，使用來自不同種族背景的人誘導多能干細胞(hiPSCs)可以產(chǎn)生幾乎任何類型的細胞。從這些干細胞中，可以很容易地構(gòu)建各種同基因型細胞系，通過精確的基因組修飾，可以產(chǎn)生與疾病相關(guān)的關(guān)鍵遺傳變異。疾病模型的快速精確構(gòu)建技術(shù)極大的提高了候選化合物驗證的效率，使?jié)撛诨衔锏玫礁鼫蚀_的評估。

• 04 先導化合物發(fā)現(xiàn)和驗證

通過對候選化合物的驗證，將候選藥物的范圍從成千上百個縮窄到只有十幾個甚至幾個。留存下來的化合物將進行結(jié)構(gòu)改造、效率優(yōu)化和安全性評估。其內(nèi)容包含表征吸收、分布、代謝和排泄(ADME)、化學穩(wěn)定性分析以及毒性分析。
?通過CRISPR技術(shù)可以產(chǎn)生用于先導化合物有效性評估和安全性評估的細胞系模型和動物模型，這一技術(shù)的使用大大的加快先導藥物驗證進程。例如，通過CRISPR技術(shù)直接編輯受精卵，可以一步產(chǎn)生多種突變的小鼠模型，其效率遠高于單點突變雜合子交配。此外，CRISPR技術(shù)還可以用于產(chǎn)生更廣泛的動物模型。?

• 05 臨床試驗和FDA申報
  

經(jīng)過效率優(yōu)化和安全性評估之后，只剩下少數(shù)候選藥物可以進入臨床試驗。只有被證明對人體安全有效的候選藥物才能最終得到FDA的批準。
?從這個階段收集到的信息通常會反饋回到臨床前研究中。例如，在臨床研究中發(fā)現(xiàn)某種化合物的耐藥性，那么在后續(xù)的研究中將探索如何抵消藥物耐藥性。

結(jié)語

CRISPR技術(shù)在推進藥理學研究方面具有巨大潛力，其影響跨越整個臨床前藥物發(fā)現(xiàn)的各個階段。CRISPR技術(shù)使基因編輯更加容易和精確，藥物作用靶點可以更快地被識別，疾病模型也可以更真實地被構(gòu)建。?此外，產(chǎn)業(yè)界和學術(shù)界的合作必將進一步拓展CRISPR技術(shù)在藥物開發(fā)中的作用。制藥公司也在投資CRISPR基礎設施建設，以開發(fā)下一代藥物。?與此同時，CRISPR技術(shù)也被用于開發(fā)新的基因療法和細胞療法，直接在患者體內(nèi)或通過體外方法調(diào)節(jié)基因表達。例如，用于靶向癌癥的CAR-T細胞療法。?CRISPR技術(shù)不僅有望以更低的成本更快地開發(fā)新的治療方法，而且還促進了個性化醫(yī)療的發(fā)展。不久，針對患者的個性化治療將不再只是一個想法。

作者：海星生物

公眾號：Cas9X細胞基因敲除

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