研究表明，增加腫瘤細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平可有效導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞損傷和死亡。然而，腫瘤高乏氧的微環(huán)境往往會影響這一策略的治療效率。有鑒于此，中山大學(xué)劉杰課題組設(shè)計了一種基于Ti?C?納米片的CD47高表達(dá)細(xì)胞膜修飾的仿生級聯(lián)酶納米反應(yīng)器，其能夠通過葡萄糖氧化酶(GOX)和氯化物過氧化物酶(CPO)級聯(lián)產(chǎn)生高活性的次氯酸(HClO)，有效殺死腫瘤細(xì)胞。同時，該酶動力治療(EDT)過程會消耗腫瘤部位的氧氣，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步乏氧，從而激化乏氧敏感前藥替拉扎明(TPZ)，協(xié)同殺死乏氧的腫瘤細(xì)胞。

A MXene-Based Bionic Cascaded-Enzyme Nanoreactor for Tumor Phototherapy/Enzyme Dynamic Therapy and Hypoxic Activated Chemotherapy

Xiaoge Zhang, Lili Cheng, Yao Lu, Junjie Tang, Qijun Lv, Xiaomei Chen, You Chen, Jie Liu*

Nano-Micro Letters (2022)14: 22

https://doi.org/10.1007/s40820-021-00761-w

本文亮點(diǎn)

1.?為阻斷CD47免疫檢查點(diǎn)，通過基因工程法構(gòu)建了CD47過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞膜，提高巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞吞噬能力。

2.?提出了一種結(jié)合腫瘤酶動力學(xué)治療、光療和乏氧激活化療的級聯(lián)酶納米反應(yīng)器。

3.?葡萄糖氧化酶和氯過氧化物酶可以產(chǎn)生足夠的HClO殺死常氧的腫瘤細(xì)胞，而替拉扎明則可以隨后被激活殺死低氧的腫瘤細(xì)胞。

內(nèi)容簡介

中山大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院劉杰課題組以Ti?C?納米片為載體，通過化學(xué)鍵連接GOX和CPO，并負(fù)載乏氧敏感前藥TPZ，制備級聯(lián)酶納米反應(yīng)器Ti?C?-GOX-CPO/TPZ (TGCT)，最后將其包裹于高表達(dá)CD47的腫瘤細(xì)胞膜囊泡中(m?TGCT)。由于高表達(dá)CD47仿生膜的包裹，m?TGCT展現(xiàn)出優(yōu)越的免疫逃逸能力和同源靶向能力，可以優(yōu)先靶向至腫瘤部位并有效提高腫瘤細(xì)胞攝取。進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，GOX和CPO可以通過級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生大量的HClO，實(shí)現(xiàn)高效EDT。此外，額外的激光照射可以加快酶催化反應(yīng)速率并進(jìn)一步增加單線態(tài)氧(1O?)的生成，同時，光療及EDT的耗氧可加重腫瘤內(nèi)部缺氧狀態(tài)，進(jìn)而激活乏氧敏感前藥替拉扎明(TPZ)實(shí)現(xiàn)化療。體內(nèi)外結(jié)果表明，m?TGCT具有腫瘤光療、EDT和化療的放大協(xié)同治療效果，可以有效抑制腫瘤生長。這種智能級聯(lián)酶納米反應(yīng)器為實(shí)現(xiàn)同步和顯著的抗腫瘤治療提供了一個有前景的方法。

圖文導(dǎo)讀

I?高表達(dá)CD47腫瘤細(xì)胞的表征

采用基因工程法策略，利用慢病毒包載質(zhì)粒對4T1腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，獲得表面高表達(dá)CD47蛋白的4T1腫瘤細(xì)胞。如圖1所示，激光共聚焦和流式結(jié)果都證明基因轉(zhuǎn)染提高了4T1腫瘤細(xì)胞表面CD47的表達(dá)。

圖1.?(a) 腫瘤細(xì)胞表面CD47蛋白表達(dá)分布的CLSM圖；(b, c) 腫瘤細(xì)胞表面CD47蛋白表達(dá)水平的流式定量圖。(***p<0.001, n=3)

II?級聯(lián)酶納米反應(yīng)器(meTGCT)的表征

本研究以塊狀Ti?C?為基體，通過液體剝離法制備得到Ti?C?納米片，在其表面通過化學(xué)鍵結(jié)合葡萄糖氧化酶和氯化物過氧化物酶，之后負(fù)載化療藥物TPZ，并在其表面包裹高表達(dá)CD47蛋白的腫瘤細(xì)胞膜，獲得級聯(lián)酶納米反應(yīng)器m?TGCT，并對其粒徑電位等理化性質(zhì)進(jìn)行了表征(圖2)。

圖2. (a) 合成路線圖；(b)?塊狀Ti?C?的EDS元素分布圖；(c)?Ti?C?納米片的TEM圖；(d) Ti?C?納米片的AFM圖；(e, f) 各組分的粒徑和電位圖；(g) XRD圖。

III?m?TGCT體外酶催化活性表征

由于GOX可以在O?條件下催化葡萄糖降解產(chǎn)生H?O?和葡萄糖酸，導(dǎo)致O?消耗和pH降低，而HClO可以催化H?O?和Cl?產(chǎn)生HClO。因此，作者進(jìn)一步研究了納米反應(yīng)器在體外酶催化活性。結(jié)果表明，相比于單一酶，級聯(lián)酶能夠有效地提高酶催化活性，且在激光照射下，溫度升高也進(jìn)一步增強(qiáng)了酶催化活性。

圖3. (a, b) 各樣品的PBS溶液(含4 mg/mL葡萄糖和25 mM?Cl?)在有無635 nm激光(0.5 W/cm2)和808 nm激光(1.5 W/cm2)照射下的溶氧變化；(c) 各樣品的PBS溶液(含4 mg/mL葡萄糖和25 mM Cl?)在有無635 nm激光和808 nm激光照射下的pH變化；(d) 各樣品的PBS溶液(含4 mg/mL葡萄糖和25 mM Cl?)在有無635 nm激光和808 nm激光照射下的HClO產(chǎn)生量；(e) 不同濃度的meTGCT溶液(含4 mg/mL葡萄糖和25 mM Cl?)的HClO產(chǎn)生量；(f) 各樣品的DPBF溶液在有無635 nm激光照射下的吸光度比值隨時間的變化。(***p<0.001, **p<0.01 and *p<0.05, n=3)

IV?m?TGC的腫瘤細(xì)胞攝取研究

癌細(xì)胞膜包裹的納米載體具有優(yōu)先的同源靶向腫瘤能力。因此，本文使用熒光染料C6標(biāo)記納米反應(yīng)器，通過共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞對納米反應(yīng)器的攝取(圖4a-c)。m?TGC的細(xì)胞攝取效率較TGC高1.9倍，證明細(xì)胞膜包裹可以提高納米反應(yīng)器的腫瘤細(xì)胞靶向能力。

V?m?TGC的促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞

CD47高表達(dá)的m?TGC通過競爭占據(jù)巨噬細(xì)胞表面的SIRPα，從而阻斷巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用。本研究分別用野生型細(xì)胞膜包裹的TGC (mwTGC)和m?TGC預(yù)處理M1巨噬細(xì)胞2 h, 將其與mCherry標(biāo)記4T1細(xì)胞共培養(yǎng)，通過激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測M1巨噬細(xì)胞吞噬4T1細(xì)胞能力(圖4d-f)。與mwTGC處理組相比，m?TGC處理后的巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞能力明顯增強(qiáng)。

VI?腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS檢測

本文通過激光共聚焦顯微鏡檢測4T1腫瘤細(xì)胞中ROS產(chǎn)生水平。與其他組相比，m?TGCT在激光照射后產(chǎn)生ROS最多，證明m?TGCT可以通過多種機(jī)制產(chǎn)生足夠的ROS用于抗腫瘤治療。

圖4. (a) 4T1腫瘤細(xì)胞攝取m?TGC/C6 4 h的激光共聚焦圖；(b, c) 細(xì)胞攝取流式定量分析圖；(d) 巨噬細(xì)胞吞噬4T1腫瘤細(xì)胞的激光共聚焦圖；(e, f) 細(xì)胞吞噬流式定量分析圖；(g) 4T1細(xì)胞中ROS水平的激光共聚焦圖。(***p<0.001, **p<0.01, n=3)

VII?腫瘤細(xì)胞內(nèi)乏氧檢測

本文通過檢測腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基里溶氧濃度變化，以及用乏氧探針抗體FITC-Mab1檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)乏氧狀況。結(jié)果證明級聯(lián)酶納米反應(yīng)器能夠有效消耗細(xì)胞內(nèi)O?水平導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞乏氧，從而有利于激活乏氧敏感前藥TPZ。

VIII?m?TGCT體外抗腫瘤細(xì)胞評價

圖5d-h結(jié)果顯示，與其他治療組相比，m?TGCT在常氧和乏氧條件下對4T1腫瘤細(xì)胞的殺傷力最強(qiáng)。細(xì)胞活死染色和凋亡也顯示m?TGCT+激光照射處理細(xì)胞后的細(xì)胞死亡率顯著高于其他組。

圖5. (a) 不同樣品處理4T1細(xì)胞后培養(yǎng)基里溶氧濃度隨時間變化；(b, c) 4T1細(xì)胞乏氧水平的激光共聚焦圖和流式定量分析圖；(d-f) 不同樣品處理4T1細(xì)胞24 h后的細(xì)胞存活率；(g) 不同樣品處理4T1細(xì)胞的活死細(xì)胞染色圖；(h) 4T1細(xì)胞凋亡圖。(***p<0.001, **p<0.01，*p<0.05, n=5)

IX?體內(nèi)熒光成像

本研究用熒光染料Cy5.5標(biāo)記納米反應(yīng)器，通過小動物活體成像儀檢測納米反應(yīng)器在體內(nèi)的生物分布。圖6結(jié)果表明，相比于其他組，m?TGC/Cy5.5組展示了增強(qiáng)的腫瘤部位靶向能力及體內(nèi)長循環(huán)性。

圖6. 體內(nèi)生物分布。(a, b) 不同樣品在4T1荷瘤小鼠體內(nèi)的熒光分布圖和熒光強(qiáng)度定量分析；(c, d) 給藥24 h后的各器官熒光分布圖和熒光強(qiáng)度定量分析圖；(e, f) 給藥120 h后的各器官熒光分布圖和熒光強(qiáng)度定量分析圖；(g) 4T1荷瘤小鼠腫瘤部位在808 nm激光(1.5 W/cm2)照射下的溫度變化。(***p<0.001, **p<0.01，n=3)

X?體內(nèi)抗腫瘤評價

為評價m?TGCT對4T1荷瘤小鼠腫瘤生長和存活率的影響，分別在第1和第7天給予荷瘤小鼠尾靜脈注射兩次納米反應(yīng)器。結(jié)果顯示，m?TGCT+激光照射治療的腫瘤生長抑制效果顯著高于其他治療組，其中有兩只小鼠的腫瘤得到完全消除，且各組小鼠體重變化無明顯區(qū)別，證明該級聯(lián)酶納米反應(yīng)器具有良好的生物安全性。

圖7. 體內(nèi)抗腫瘤作用。(a) 4T1荷瘤小鼠腫瘤治療流程圖；(b) 各組小鼠治療期間相對腫瘤體積變化圖；(c) 各組荷瘤小鼠腫瘤治療期間體重變化圖；(d) 各組小鼠治療第31天后的瘤重定量圖；(e) 治療第31天時的小鼠和腫瘤組織照片；(f) 各組小鼠腫瘤組織TUNEL圖。(與對照組相比，***p<0.001, **p<0.01 and *p<0.05具有顯著性差異；###p<0.001,?##p<0.01,?#p<0.05, n=5)

作者簡介

劉杰

本文通訊作者

中山大學(xué) 教授

▍主要研究領(lǐng)域

靶向納米藥物/基因載體系統(tǒng)、多功能納米診療一體化生物材料和器官芯片/體外3D腫瘤模型的設(shè)計、構(gòu)建及應(yīng)用。

▍主要研究成果

近年來在生物材料、藥物遞送領(lǐng)域做出了較大貢獻(xiàn)?，F(xiàn)已在Nature Materials, Advanced Science, Small, Biomaterials, Bioactive Materials等國際知名期刊上發(fā)表論文60余篇，被引1900余次，獲授權(quán)發(fā)明專利8項(xiàng)。

▍Email:?liujie56@mail.sysu.edu.cn

張曉戈

本文第一作者

中山大學(xué) 博士研究生

▍主要研究領(lǐng)域

二維無機(jī)納米材料異質(zhì)結(jié)的設(shè)計及其在腫瘤治療方面的應(yīng)用。

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