自2003年爆發(fā)的SARS，至今的冠狀病毒2019-nCoV，這類的嚴(yán)重疾病罪魁禍?zhǔn)坠跔畈《?，其基因組為線性單股正鏈的RNA病毒，具有高突變率和快速適應(yīng)的潛力，那么病毒的耐藥性對(duì)于抗病毒藥物的研發(fā)則是一個(gè)嚴(yán)峻的考驗(yàn)。而對(duì)于靶向細(xì)胞的功能，相較于靶向病毒功能的研究，能夠更大程度減少耐藥性的發(fā)展。結(jié)合病毒在其復(fù)制周期中，與宿主細(xì)胞在多層面上的相互作用，則是其抗病毒感染的關(guān)鍵因素，從而可作為藥物開(kāi)發(fā)的抗病毒策略。

今天小優(yōu)就為大家?guī)?lái)一篇關(guān)于SARS冠狀病毒的研究，一起來(lái)看看萊頓大學(xué)的研究人員，如何利用基因調(diào)控文庫(kù)篩選病毒侵染宿主途徑中關(guān)鍵因素，為您提供高效的科研思路。

以人激酶組為靶點(diǎn)，利用siRNA文庫(kù)篩選影響SARS冠狀病毒復(fù)制的主要因素
為了進(jìn)一步了解宿主因素在SARS-CoV復(fù)制周期中的作用，2013年萊頓大學(xué)研究人員以多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子——人蛋白激酶組779個(gè)基因?yàn)榘悬c(diǎn)，利用RNAi基因沉默技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)的功能基因組學(xué)篩選。

293/ACE2細(xì)胞作為宿主細(xì)胞接種于779個(gè)孔中，以人激酶組779個(gè)基因?yàn)榘悬c(diǎn)，使用Dharmacon ON-TARGETplus SMARTpool siRNA-蛋白激酶文庫(kù)，同時(shí)轉(zhuǎn)染779個(gè)基因siRNA至293/ACE2細(xì)胞，并于基因下調(diào)表達(dá)48h，感染MOI=10重組GFP標(biāo)簽SARS冠狀病毒（SARS-CoV-GFP） 24h。同時(shí)設(shè)置平行對(duì)照組，僅完成779個(gè)基因siRNA轉(zhuǎn)染同時(shí)下調(diào)表達(dá)，驗(yàn)證其siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞活性的影響。最終通過(guò)在96孔板中測(cè)定SARS-CoV-GFP的熒光GFP表達(dá)值。

通過(guò)對(duì)GFP熒光表達(dá)值分析，發(fā)現(xiàn)在同時(shí)下調(diào)779個(gè)基因mRNA的前提下感染重組SARS-CoV-GFP，并同時(shí)設(shè)置無(wú)任何靶基因敲低并感染重組SARS-CoV-GFP的對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)有38個(gè)基因的下調(diào)表達(dá)后，與對(duì)照組相比其GFP表達(dá)增加至少1.5倍，有10個(gè)基因的下調(diào)表達(dá)后相較于對(duì)照組GFP表達(dá)下降至少2倍以上。 ? ?

初步將這些通過(guò)siRNA文庫(kù)篩選得到的關(guān)鍵基因結(jié)合IPA軟件分析，其不僅發(fā)揮抗病毒或病毒前體復(fù)制的關(guān)鍵作用，同時(shí)也參與多種細(xì)胞途徑，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞免疫應(yīng)答、生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、復(fù)雜脂質(zhì)的代謝以及細(xì)胞內(nèi)和第二信使信號(hào)傳導(dǎo)。

通過(guò)前期siRNA文庫(kù)篩選得出，COPB2的下調(diào)表達(dá)后感染SARS-CoV-GFP 重組病毒，其熒光報(bào)告基因GFP表達(dá)下調(diào)82%，由此推斷COPB2作為病毒前體復(fù)制的最為關(guān)鍵因素。

為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論，通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)COPB2 shRNA慢病毒至293 / ACE2細(xì)胞，敲低COPB2的表達(dá)至使下調(diào)約70% (Fig 1A)，并且COPB2表達(dá)水平敲低并不影響細(xì)胞活力 (Fig 1B)。隨后用SARS-CoV-GFP（MOI 0.01）感染COPB2敲低表達(dá)的細(xì)胞，導(dǎo)致在32 h時(shí)SARS N蛋白和GFP表達(dá)下降。為了驗(yàn)證重組SARS-CoV-GFP感染敲低實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛘_反映野生SARS-CoV的特征，同時(shí)分析了感染也省SARS-CoV后24小時(shí)內(nèi)COPB2耗盡細(xì)胞中SARA N蛋白的表達(dá)明顯減少 (Fig 1C)。并且來(lái)自SARS-CoV-GFP感染細(xì)胞（32 h p.i.）和野生SARS-CoV感染細(xì)胞（24 h p.i.）的培養(yǎng)上清液的滴定顯示，兩種病毒均降低了2-3個(gè)對(duì)數(shù)（Fig 1D）。

COPB2作為涂層蛋白復(fù)合物的其中一個(gè)亞基，可驅(qū)動(dòng)形成COPI涂層的囊泡，在早期分泌途徑中發(fā)揮逆行轉(zhuǎn)運(yùn)作用，同時(shí)在這一過(guò)程中，GBF1激活A(yù)DP-核糖激化因子1介導(dǎo)COPI包被的囊泡形成，而COPB1和GBF1作為早期分泌途徑的蛋白質(zhì)，對(duì)于SARS-CoV復(fù)制同樣很重要。為進(jìn)一步證實(shí)COPI包被的囊泡對(duì)SARS-CoV復(fù)制的重要性，針對(duì)COPB1和GBF1分別轉(zhuǎn)染其特異性siRNA至293 / ACE2細(xì)胞，于48h后分別敲低表達(dá)水平，感染SARS-CoV-GFP（MOI 10）,并于24h后重組病毒GFP表達(dá)量降低約83%（COPB1）和89%（GBF1） (Fig 1E)。

? ? ? ? ? ?綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，COPB2和COPI涂層的囊泡在SARS-CoV復(fù)制中起著至關(guān)重要的作用。

經(jīng)由siRNA蛋白激酶文庫(kù)篩選，除了篩選得出SARS-CoV前提復(fù)制的關(guān)鍵因素，還有可使重組病毒GFP表達(dá)增強(qiáng)至少2倍的抗病毒關(guān)鍵因子——PKR。為進(jìn)一步驗(yàn)證PKR在SARS-CoV復(fù)制中的抗病毒作用，同樣的思路，對(duì)其PKR進(jìn)行敲低表達(dá)48h，并感染野生SARS-CoV 24h,分析得出經(jīng)PKR蛋白水平敲低后，SARS N蛋白表達(dá)量上調(diào)，并且病毒感染上清液滴度增加了約1個(gè)對(duì)數(shù)。說(shuō)明了PKR在SARS-CoV感染的細(xì)胞中具有真正的抗病毒作用（Fig 2）。

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該篇文獻(xiàn)利用系統(tǒng)功能基因組學(xué)的方式篩選得出影響SARS-CoV感染宿主的關(guān)鍵因子PKR和COPB2，并通過(guò)基因調(diào)控結(jié)合SARS-CoV感染所發(fā)生的表型或表達(dá)情況等，進(jìn)一步證實(shí)了宿主PKR和COPB2在其病毒侵染宿主過(guò)程中發(fā)揮的抗病毒及影響病毒前體復(fù)制關(guān)鍵作用。并且文章中也提及到，利用該種方式不僅針對(duì)SARS-CoV，還確定了多種RNA病毒復(fù)制的關(guān)鍵因素。為后續(xù)進(jìn)一步深入的探討提供了一個(gè)數(shù)據(jù)起點(diǎn)及理論基礎(chǔ)，幫助病毒侵染宿主過(guò)程中新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，以及后續(xù)的抗病毒治療等。

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