雙雜交技術(shù)是研究蛋白與蛋白互作的技術(shù)。

涉及到的理論知識

轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)錄因子/結(jié)構(gòu)域的獨立性/雙雜交法

• 轉(zhuǎn)錄過程

真核生物RNA的轉(zhuǎn)錄在細胞核內(nèi)進行的，蛋白質(zhì)的合成則是在細胞質(zhì)中進行的。

轉(zhuǎn)錄起始包含了許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，這些蛋白質(zhì)也就是結(jié)合在增強子上的轉(zhuǎn)錄因子以及在啟動子上所裝配的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置，如RNA聚合酶等。

• 轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）：

轉(zhuǎn)錄因子是一群能與基因5'端上游特定序列專一性結(jié)合，從而保證目的基因以特定強度在特定時間與空間表達的蛋白質(zhì)分子。

(轉(zhuǎn)錄因子用于識別基因的啟動子區(qū)域，激活mRNA的表達）

我們可以將轉(zhuǎn)錄因子分為作用相反的兩類：正激活物和負阻遏物。

• 在真核生物中，正向控制的轉(zhuǎn)錄因子中，有一類稱為真激活因子（true activator）。

真激活因子是一種經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子，它可與啟動子上的基礎(chǔ)裝置發(fā)生直接的接觸而發(fā)揮功能，這種方式或者是直接的，或者是通過輔激活因子而間接發(fā)生。

激活因子的結(jié)構(gòu)域性質(zhì)：

如下圖所示，激活因子通常具有分開的結(jié)構(gòu)域，它們分別結(jié)合DNA并激活轉(zhuǎn)錄。當(dāng)它與另一類型的結(jié)構(gòu)域連接在一起時，每個結(jié)構(gòu)域可作為一個單獨的模塊而獨立發(fā)揮作用。而整體轉(zhuǎn)庫復(fù)合體的結(jié)構(gòu)特征必須要轉(zhuǎn)錄激活域和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置相聯(lián)系，而不管結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域的確切定位和取向。

Q：圖片和圖片上一段話要表達什么意思呢？

A：即轉(zhuǎn)錄因子中，DNA結(jié)合域、激活域是相互獨立的，但在一條途徑中是有聯(lián)系的，它允許轉(zhuǎn)錄激活和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置相互作用，而這種作用于DNA結(jié)合域的取向和具體定位無關(guān)。

Q:一般，想要激活轉(zhuǎn)錄，一個先決條件就是與DNA結(jié)合（有例外的）。那活化作用依賴于特定的DNA結(jié)合域嗎？

A：無關(guān)緊要。

因為DNA結(jié)構(gòu)域的功能是將轉(zhuǎn)錄激活域帶到啟動子中的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置上，而精確知道如何結(jié)合、結(jié)合位置等是不需要的，只要它能在那里存在，轉(zhuǎn)錄激活就會發(fā)生作用，所以，DNA結(jié)合位點的精確位置可以不同。

因為對連接域無要求 ，所以我們擁有了雙雜技術(shù)的理論依據(jù)：

雙雜交法（研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作）

理論依據(jù)：上文所介紹的結(jié)構(gòu)域獨立模型

注：DBD:DNA結(jié)合域? ? ?? ? ?AD：轉(zhuǎn)錄激活域

雙雜的技術(shù)手段：

我們將某轉(zhuǎn)錄因子分拆開為DNA結(jié)合域BD和轉(zhuǎn)錄激活域AD兩部分，

我們將其中一個待測蛋白質(zhì)融合到DNA結(jié)合域（BD），將另一個蛋白質(zhì)融合到轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。如果這兩個蛋白質(zhì)可相互作用，那么這兩個融合蛋白就會相互作用。

∴? ? ?誘餌蛋白+BD? ? ???? ? ? 獵物蛋白+AD??

如上圖所示，通過融合技術(shù)，我們得到融合蛋白，使得一些蛋白質(zhì)有DNA結(jié)構(gòu)域，另一些含有轉(zhuǎn)錄激活域。

技術(shù)優(yōu)勢：它僅需要兩個被測蛋白就能相互作用，而不需要任何與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的東西。（因為DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域是獨立的，所以我們需要的就是把它們放在一起就好啦。）

核系統(tǒng)酵母雙雜交技術(shù)（Two-hybrid system ,Y2H）

即利用真核模式生物酵母，在其體內(nèi)研究兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用。

這里用到了酵母細胞中的轉(zhuǎn)錄因子GAL4

酵母文庫中的轉(zhuǎn)錄因子GAL同樣也包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）。

BD用于識別基因的啟動子區(qū)域,AD用于激活mRNA的表達。

BD和AD同時存在，才會起到轉(zhuǎn)錄因子的功能?，單獨存在則無作用。

我們將已知蛋白稱作Bait,即誘餌蛋白。利用誘餌蛋白找尋可以相互作用的蛋白（獵物蛋白Prey）。

酵母雙雜的技術(shù)手段：我們將GAL4分拆開為BD和AD兩部分

∴ 融合蛋白1：誘餌蛋白+BD? ? ? ??? ? ?融合蛋白2：? 獵物蛋白+AD??

如果誘餌蛋白和獵物蛋白進行結(jié)合，則 BD 、AD也會碰面（形成一個大的融合蛋白）激活下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。

如下圖，在酵母的細胞核中，這個大融合蛋白靠GAL4的BD部分去識別酵母細胞基因組上的啟動子，靠AD部分激活基因的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生一個可識別的信號

Tip:

我們放進酵母細胞里的不是蛋白，而是含待測蛋白基因的質(zhì)粒。

即構(gòu)建兩個質(zhì)粒? ，?如下圖：

∴要導(dǎo)入兩個質(zhì)粒：一個含有BD 、誘餌蛋白基因（Bait） ；一個含有AD、獵物蛋白基因(Prey)

如下圖，最終表達出來的是兩個融合蛋白。一個是BD蛋白+誘餌蛋白，一個是AD蛋白+獵物蛋白

理解重點：

Q：那我們?nèi)绾慰闯鰜韮蓚€蛋白相互作用呢？

A：通過我們的報告基因打報告~

含GAL4DNA結(jié)合域BD的誘餌蛋白Bait可結(jié)合報道基因，而報道基因上含有一個簡單的啟動子，它包含了此DNA結(jié)合域的靶位點，但它自身不能激活這個基因。只有第一個與第二個融合蛋白結(jié)合，把轉(zhuǎn)錄激活域AD（帶著我們的獵物蛋白Prey）帶到啟動子后才能激活這個基因。

Q:酵母細胞中的報告基因有哪些？

與大腸桿菌采用抗生素篩選的策略不同，酵母系統(tǒng)常采用營養(yǎng)標(biāo)記作為報告基因。

常用的報告基因有AbAr 、HIS3、URA3 、LacZ和ADE2等，對應(yīng)的宿主菌則是相應(yīng)標(biāo)記的缺陷型細胞，必須要在含有該營養(yǎng)標(biāo)記的培養(yǎng)基中生長。

eg：

GAL4系統(tǒng)中的酵母菌種經(jīng)過基因改造后既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成亮氨酸（LEU）、色氨酸（TRP）、組氨酸TRP)、腺嘌呤（ADE），因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基（SD-LEU-TRP-HIS-ADE,四缺）上無法正常生長。只有當(dāng)有相互作用的蛋白存在時，激活報告基因的表達，從而通過功能互補，能夠在不含營養(yǎng)標(biāo)記的培養(yǎng)基中生長，以此驗證是否存在相互作用。同樣的，也可以通過顯色反應(yīng)進一步確認是否有相互作用。

***共總結(jié)出三類報告基因供篩選

1.營養(yǎng)缺陷篩選型（上文舉過例子了）

酵母細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基上，可以少放營養(yǎng)成分

原理：如果營養(yǎng)成分缺失，GAL4轉(zhuǎn)錄因子無法存活。

但如果誘餌蛋白和獵物蛋白可以結(jié)合，組合成一個完整的轉(zhuǎn)錄因子后，這個轉(zhuǎn)錄因子會去激活合成這些營養(yǎng)成分的氨基酸去表達，讓酵母細胞自給自足，可以存活。

2.抗性篩選

我們在培養(yǎng)基里加入Aba 等有毒物質(zhì)

但如果誘餌蛋白和獵物蛋白可以結(jié)合，組合成一個完整的轉(zhuǎn)錄因子后，這個轉(zhuǎn)錄因子會去降解這些毒性成分，酵母可以存活。

3.藍白斑篩選

在培養(yǎng)基中加入X-α-gal?,這個成分在自然狀態(tài)下是無色的，但如果誘餌蛋白和獵物蛋白可以結(jié)合，組合成一個完整的轉(zhuǎn)錄因子后，這個基因會催化X-α-gal發(fā)生轉(zhuǎn)化，會將酵母變成藍色。

∴經(jīng)過多篩，能存活，且成藍色的酵母，里面會有誘餌蛋白和獵物蛋白真正的結(jié)合

酵母雙雜交技術(shù)的優(yōu)點：

1.高敏感性

即便誘餌/獵物蛋白表達量很低，但是，檢測的結(jié)果是表達產(chǎn)物的累計效應(yīng)（人話：讓酵母多長一會兒，增加表達量），可檢測存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時的相互作用

2.真實性

在活的酵母細胞內(nèi)表達，蛋白是天然表達的，所以真實

3.簡捷性

融合蛋白相互作用后，不需要去制備抗體、純化蛋白等步驟

4.廣泛性

采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料構(gòu)件cDNA文庫，能分析不同蛋白質(zhì)的互作

酵母雙雜交技術(shù)的缺陷：

*假陽性

可能原因：

*誘餌蛋白或獵物蛋白有自激活的功能，或誘餌蛋白或獵物蛋白與酵母中其他蛋白相互作用

*誘餌蛋白或獵物蛋白可能與酵母的DNA序列結(jié)合 ，出現(xiàn)假陽性結(jié)果

*假陰性

*在某些酵母菌株中大量表達外源蛋白質(zhì)會帶來毒性作用，從而影響菌株生長及報告基因的表型（即其他物種的蛋白對酵母細胞有毒性）

eg:在培養(yǎng)基中加入的Aba 、3-AT對酵母有影響

酵母雙雜交技術(shù)的局限性

*如果某些哺乳動物細胞蛋白質(zhì)是經(jīng)過翻譯后加工才能相互作用，則該系統(tǒng)也不適用。因為叫酵母的后加工系統(tǒng)與哺乳細胞后加工系統(tǒng)不盡相同。

*因為高等動植物的轉(zhuǎn)錄翻譯的調(diào)控復(fù)雜，如在蛋白形成后會經(jīng)過一系列復(fù)雜的修飾，如乙?；?、泛素化、磷酸化等，如果酵母的蛋白加工中沒有這些，則篩選不到互作的蛋白了

*需要誘餌蛋白和獵物蛋白基因進入細胞核內(nèi)，因而不能被轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)如細胞質(zhì)蛋白、細胞膜蛋白的與研究就不適合

需要用膜系統(tǒng)的酵母雙雜交技術(shù)

膜系統(tǒng)酵母雙雜交技術(shù)(淺談)

膜系統(tǒng)(Dualsystemd split-ubiquitin )

Ubiquitin ,即泛素蛋白，可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)的降解 。

和核系統(tǒng)類似：泛素蛋白由兩個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域組成：C端結(jié)構(gòu)域和N端結(jié)構(gòu)域。只有兩端都存在才能使泛素蛋白發(fā)揮作用

誘餌蛋白+C端 ? ? ? 獵物蛋白+N端

泛素蛋白有連接一個轉(zhuǎn)錄因子LexA-VP16。

這個泛素蛋白完整結(jié)合后，首先會將這個轉(zhuǎn)錄因子切掉，如下圖。

轉(zhuǎn)錄因子會進入細胞核內(nèi)進行表達，發(fā)出信號。這個轉(zhuǎn)錄因子具有識別結(jié)構(gòu)域LexA 和激活結(jié)構(gòu)域VP16

膜系統(tǒng)技術(shù)原理：

誘餌蛋白和獵物蛋白雖然自身不能進入細胞核，但是泛素蛋白自身結(jié)合后，會切割掉LexA-VP16轉(zhuǎn)錄因子 ，去進入核內(nèi)發(fā)出信號

*做膜系統(tǒng)酵母雙雜時，要進行蛋白質(zhì)跨膜方向的預(yù)測，這個影響到我們需要選擇的質(zhì)粒類型

對文庫類型的選擇取決于蛋白質(zhì)的位置

• 誘餌蛋白位于細胞核-------核系統(tǒng)

• 誘餌蛋白定位于細胞膜

? ? ? ? ?1.N端或C端任意一端或者兩端位于胞內(nèi)選擇膜系統(tǒng)

? ? ? ? ?2.蛋白兩端均在胞外需進行功能域預(yù)測，根據(jù)跨膜結(jié)構(gòu)進行部分切除后，選擇膜系統(tǒng)或核系統(tǒng)

• 誘餌蛋白定位于細胞質(zhì)------核、膜系統(tǒng)均可

  
  

  
  

Q：那么怎么知道我要的這個蛋白位于細胞核、細胞膜還是細胞質(zhì)呢？

? 方法一：做個實驗：亞細胞定位實驗?

在細胞中表達誘餌蛋白，在誘餌蛋白上添加一個信號：綠色熒光蛋白/黃色熒光蛋白，通過觀察熒光在細胞內(nèi)的分布來判定該蛋白位于細胞什么位置上

? 方法二：理論預(yù)測

使用網(wǎng)站---粘貼誘餌蛋白序列--看位置