??前兩期我們介紹了免疫沉淀技術(shù)中用于研究蛋白與蛋白相互作用的免疫共沉淀，然而可以與蛋白質(zhì)相互作用的不只有蛋白質(zhì)，還有DNA和RNA等。本期將重點(diǎn)介紹蛋白質(zhì)與DNA相互作用的研究方法，染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是目前唯一研究二者互作關(guān)系的技術(shù)。ChIP可以完整真實(shí)地反映細(xì)胞中特定蛋白與DNA的結(jié)合關(guān)系，將蛋白-DNA復(fù)合物分離出來(lái)進(jìn)一步研究特定的結(jié)合蛋白或與其結(jié)合的DNA，結(jié)合qPCR（ChIP-qPCR）可實(shí)現(xiàn)定量分析，結(jié)合二代測(cè)序（ChIP-seq）可對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行測(cè)序分析等。

ChIP實(shí)驗(yàn)原理

?????? ChIP的基本原理與Co-IP類似，即用DNA結(jié)合蛋白的抗體去沉淀得到蛋白-DNA復(fù)合物。簡(jiǎn)單講，使用甲醛將活細(xì)胞固定，以保留細(xì)胞內(nèi)的蛋白-DNA復(fù)合物，隨后采用超聲或核酸酶將DNA隨機(jī)切斷成一定長(zhǎng)度的小片段，接著用特定蛋白抗體結(jié)合并富集蛋白-DNA片段復(fù)合物，最后將復(fù)合物純化、解聯(lián)后檢測(cè)得到的DNA片段。

ChIP一般實(shí)驗(yàn)流程

?????? 由于不同公司的ChIP實(shí)驗(yàn)試劑盒操作細(xì)節(jié)不同，根據(jù)所使用的試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作劑盒，這里整理的一般實(shí)驗(yàn)過(guò)程，可以先大致有個(gè)整體參考了解。

圖 ChIP實(shí)驗(yàn)流程和分析方法[1]

1、? 固定細(xì)胞（交聯(lián)染色質(zhì)）

ChIP檢測(cè)首先需要將蛋白-DNA復(fù)合物固定，最常用1%甲醛溶液進(jìn)行固定，固定作用是可逆的。固定時(shí)間需要注意，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致染色質(zhì)難以切斷且得不到合適的長(zhǎng)度，時(shí)間過(guò)短可能會(huì)導(dǎo)致固定不足。甘氨酸可以終止交聯(lián)反應(yīng)。若細(xì)胞固定后暫時(shí)不能繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，可將細(xì)胞保存至-80℃。

2、? 細(xì)胞裂解

固定、收集細(xì)胞后，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。

3、? 切斷染色質(zhì)

將細(xì)胞裂解液通過(guò)機(jī)械超聲或微球菌核酸酶消化切斷DNA，得到平均大小為200-1000bp的染色質(zhì)小片段。這一步得到的染色質(zhì)片段可在-80℃下保存3個(gè)月左右。

4、? 免疫沉淀

將目的蛋白的特異性抗體固定在磁珠上，與蛋白－DNA復(fù)合物在4℃搖床孵育過(guò)夜，離心去上清后得到蛋白－DNA復(fù)合物；然后用洗滌緩沖液洗滌沉淀物三次，每次洗滌后需離心去上清。

5、? 洗脫、富集蛋白-DNA復(fù)合物

? 在洗滌好的沉淀復(fù)合物中加入洗脫緩沖液，以洗脫DNA，再離心收集上清液。

6、? 解交聯(lián)、純化DNA

? 用NaCl和蛋白酶K解除蛋白與DNA之間的交聯(lián)，還可使用RNase A以去除殘余RNA。通過(guò)PCR將DNA進(jìn)行純化回收。

7、? 分析檢測(cè)

純化得到的DNA通過(guò)ChIP-qPCR或ChIP-seq進(jìn)行分析。在已知靶基因區(qū)域時(shí)，可針對(duì)該區(qū)域設(shè)計(jì)qPCR引物，通過(guò)ChIP-qPCR可進(jìn)行快速的定量分析；若是不確定靶基因的情況下，可通過(guò)ChIP-seq來(lái)檢測(cè)分析DNA片段。

以上即是ChIP實(shí)驗(yàn)的原理和一般實(shí)驗(yàn)流程，下期我們將進(jìn)一步介紹ChIP相關(guān)內(nèi)容，歡迎大家持續(xù)關(guān)注。漢恒生物專注病毒包裝十余年，若有任何相關(guān)需求或技術(shù)問(wèn)題歡迎隨時(shí)與我們聯(lián)系~

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參考文獻(xiàn)：

[1] Collas P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 2010 May;45(1):87-100. doi: 10.1007/s12033-009-9239-8.