圖3 |?三種代謝物誘導(dǎo)癌細(xì)胞侵襲結(jié)果

3.?代謝物MMA可誘導(dǎo)癌細(xì)胞侵襲

MMA主要是丙酸代謝副產(chǎn)物的二羧酸。丙酰輔酶A是由支鏈氨基酸和奇數(shù)鏈脂肪酸的分解代謝產(chǎn)生的，其生成的琥珀酰輔酶A的方式依賴于維生素B12為三羧酸循環(huán)提供燃料。MMA的積累是由于該途徑中酶的通量增加和（或）失調(diào)所致，并且是一組稱為甲基丙二酸血癥的先天性代謝疾病以及維生素B12缺乏癥的標(biāo)志物。

通過測量所有60位供體血清中MMA的絕對濃度，其結(jié)果表明，老年血清（15–80μM）中MMA水平高于年輕血清（0.1–1.5μM）（圖4a）。此外，在10個異常樣本(5個來自未誘導(dǎo)EMT的老年捐贈者，5個來自誘導(dǎo)EMT的年輕捐贈者)中，MMA水平始終與在癌細(xì)胞中觀察到的表型相關(guān)(圖5g)。已知維生素B12水平會隨著年齡的增長而下降，通過對血清中維生素B12的測量顯示，老年捐獻(xiàn)者的維生素B12水平略有下降（圖5h），然而，這種下降與離群樣本中的MMA水平無關(guān)（圖5i）。雖然不能排除維生素B12缺乏導(dǎo)致MMA隨年齡增加的可能性，但其他因素如主要器官丙酸代謝的失調(diào)也可能與此有關(guān)。

為了更好地理解MMA的促侵襲性質(zhì)，用MMA處理HCC1806，A549和MCF-10A細(xì)胞。1mM及以上的濃度足以誘導(dǎo)EMT樣表型和促侵襲性蛋白的表達(dá)（圖4b）。MMA還能增加細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖4c），并促進(jìn)干細(xì)胞樣特性。用MMA體外處理MDA-MB-231細(xì)胞增加了侵襲性標(biāo)志物并且足以以濃度依賴性方式穩(wěn)健地增加細(xì)胞以無胸腺小鼠肺定殖的能力（圖4d）。為了評估血清中的另一種成分是否可以促進(jìn)MMA進(jìn)入癌細(xì)胞，采用兩種不影響MMA等極性代謝物的方法去除了脂質(zhì)或大于3 kDa分子的老年血清，結(jié)果表明誘導(dǎo)促侵襲性質(zhì)的能力被消除，同時血清MMA水平顯著降低。這意味著負(fù)責(zé)該表型的MMA與血清中大于3kDa的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)合，促進(jìn)其進(jìn)入癌細(xì)胞。

總之，與脂質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)合的MMA是一種循環(huán)因子，有助于癌細(xì)胞衰老的促侵襲作用，并足以驅(qū)動腫瘤進(jìn)展和侵襲性。

圖4?|?MMA誘導(dǎo)癌細(xì)胞的侵襲性特征

a、所有血清樣品中MMA的濃度；

b、用MMA處理10天的A549細(xì)胞的免疫印跡；

c、用MMA處理10天的MCF-10A細(xì)胞的遷移力和侵襲測定；

d、用MMA處理5天的MDA-MB-231-熒光素酶細(xì)胞的肺定植測定；

e、血清MMA最終濃度；

f、原發(fā)腫瘤的生物發(fā)光強(qiáng)度；

g、用MDA-MB-231-熒光素酶細(xì)胞轉(zhuǎn)移至每天皮下注射MMA的小鼠；

h、用MDA-MB-231-熒光素酶細(xì)胞異種移植并用MMA皮下或通過飲用水處理的小鼠的Kaplan-Meier曲線

圖5?|?異常樣本與整體樣本

g、異常樣本的MMA濃度；

h、整體樣本的維生素B12濃度；

i、異常樣本的維生素B12濃度

4.?MMA通過激活TGFβ信號傳導(dǎo)和隨后誘導(dǎo)SOX4觸發(fā)促侵襲性轉(zhuǎn)錄重編程

為了研究MMA如何促進(jìn)觀察到的細(xì)胞可塑性，用MMA處理10天的A549細(xì)胞中進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)MMA誘導(dǎo)顯著的轉(zhuǎn)錄重編程?；蚣患治?GSEA)顯示MMA調(diào)節(jié)與細(xì)胞命運(yùn)決定相關(guān)的遺傳程序。通過篩選MMA處理后表達(dá)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)這些最上調(diào)的一種轉(zhuǎn)錄因子是SOX4。在用不同濃度的MMA處理的各種細(xì)胞模型中以及在用老化血清培養(yǎng)的細(xì)胞中SOX4的水平顯著增加（圖6a，b）。用MMA或用老年血清處理后，細(xì)胞在無胸腺小鼠的肺中形成集落（圖6c，d）。

接下來研究MMA如何改變SOX4水平。通過RNA測序數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析顯示TGFβ信號傳導(dǎo)途徑的幾個組分增加，包括TGFβ-2配體的上調(diào)。證實(shí)了TGFβ-2 mRNA的增加，其與用MMA處理的癌細(xì)胞培養(yǎng)基中TGFβ-2豐度隨時間的增加相關(guān)（圖6e）。此外，為支持這些發(fā)現(xiàn)的生理相關(guān)性，對來自循環(huán)MMA水平升高的小鼠的腫瘤組織的分析顯示，TGFβ-2 mRNA顯著上調(diào)，同時誘導(dǎo)TGFβ信號傳導(dǎo)和SOX4上調(diào)（圖6f，g）。為了測試TGFβ信號傳導(dǎo)的激活是否負(fù)責(zé)SOX4的上調(diào)，同時用MMA和TGFβ受體抑制劑或泛TGFβ中和抗體處理癌細(xì)胞。培養(yǎng)基中TGFβ受體的抑制和TGFβ配體的中和足以阻斷MMA誘導(dǎo)SOX4表達(dá)和促侵襲性質(zhì)的能力（圖6h）。這些數(shù)據(jù)表明MMA依賴于以自分泌方式激活TGFβ信號傳導(dǎo)以誘導(dǎo)SOX4，并因此誘導(dǎo)維持腫瘤進(jìn)展的細(xì)胞可塑性所必需的轉(zhuǎn)錄重編程。

圖6?|?MMA通過激活TGFβ信號傳導(dǎo)和隨后誘導(dǎo)SOX4觸發(fā)促侵襲性轉(zhuǎn)錄重編程

a，b、用MMA（血清）處理10天的免疫印跡；

c，d、5天內(nèi)用SOX4基因沉默5mM MMA（老年血清）處理的MDA-MB-231-熒光素酶細(xì)胞的肺定植測定；

e、經(jīng)5mM MMA處理的A549細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中TGFβ-2配體的水平；

f，g、通過qPCR（免疫印跡）測定注射較低劑量MMA的小鼠腫瘤樣品中的TGFβ-2 mRNA；

h、在TGFβ中和抗體存在下用5mM MMA處理的A549細(xì)胞的免疫印跡

研究結(jié)論

綜上所述，本研究結(jié)果表明機(jī)體衰老的代謝失調(diào)有助于腫瘤發(fā)展的侵襲性特性。具體而言，衰老促進(jìn)MMA的增加，這反過來賦予癌細(xì)胞作為轉(zhuǎn)移性病變遷移，侵入，存活和繁殖所必需的性質(zhì)，這導(dǎo)致癌癥相關(guān)存活率降低。盡管需要更深入的研究來充分確定導(dǎo)致致瘤過程的年齡驅(qū)動變化的范圍，但本研究證明了代謝重編程是衰老與腫瘤發(fā)生間的重要關(guān)系。

小鹿推薦

本文研究了促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)展和侵襲的外在因素—衰老。通過在兩組年齡的人血清中培養(yǎng)癌細(xì)胞證明了衰老會形成一個有助于癌細(xì)胞發(fā)展和侵襲的身體環(huán)境。通過有機(jī)酸靶向代謝組學(xué)分析了人血清的代謝物組成，發(fā)現(xiàn)只有三種代謝物在老年血清種增加，并最終確定了甲基丙二酸MMA與脂質(zhì)結(jié)合的復(fù)合因子負(fù)責(zé)誘導(dǎo)癌細(xì)胞侵襲的作用。

文末看點(diǎn)

上海鹿明生物科技有限公司多年來，一直專注于生命科學(xué)和生命技術(shù)領(lǐng)域，是國內(nèi)早期開展以蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)為基礎(chǔ)的多層組學(xué)整合實(shí)驗(yàn)與分析的團(tuán)隊(duì)。目前在多層組學(xué)研究已經(jīng)有了成熟的技術(shù)方法。

有機(jī)酸代謝組學(xué)可以用在哪些研究呢？

疾病標(biāo)志物篩選

病因與病理機(jī)制探究
疾病復(fù)發(fā)診斷
臨床療效評價(jià)
藥物毒理學(xué)評價(jià)
新生兒篩查/遺傳病篩查前研究

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