今天給同學(xué)們分享一篇單基因+泛癌+甲基化+實(shí)驗(yàn)的生信文章“Integrated pan-cancer analysis and experimental verification of the roles of tropomyosin 4 in gastric cancer”，這篇文章于2023年3月13日發(fā)表在

Front Immunol期刊上，影響因子為8.786。

全球范圍內(nèi)，胃癌在發(fā)病率上排名第五，在死亡率上排名第三。早期腫瘤可以通過(guò)內(nèi)窺鏡手術(shù)或根治性胃癌手術(shù)切除。然而，由于胃癌具有高度侵襲性，大多數(shù)被診斷出患有胃癌的患者表現(xiàn)出晚期胃癌進(jìn)展，并且很可能正在接受氟尿嘧啶和鉑類(lèi)化療治療。分子靶向藥物，如曲妥珠單抗（抗人表皮生長(zhǎng)因子受體2，HER-2）和尼伐替尤單抗免疫療法（抗程序性細(xì)胞死亡蛋白1，PD-1），逐漸改善了患者的預(yù)后，但并非所有情況都適用。因此，迫切需要確定新的預(yù)后生物標(biāo)志物和分子靶點(diǎn)，以預(yù)測(cè)胃癌患者的預(yù)后并指導(dǎo)個(gè)體化治療。

圖1 流程圖

1. TPM4表達(dá)水平及其亞細(xì)胞定位

HPA數(shù)據(jù)集顯示TPM4在泌尿生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)中的表達(dá)排名靠前（圖2A）。TCGA和GTEx數(shù)據(jù)集顯示TPM4在BRCA、CHOL、COAD、DLBC、ESCA、GBM、HNSC、LAML、LGG、LIHC、LUCS、OV、PAAD、PCPG、PEAD、READ、SARC、STAD和TGCT中顯著上調(diào)（P < 0.05）。相反，TPM4在BLCA、KICH、KIRP、LUAD、PRAD、LUSC、SKCM、THCA、THYM、UCEC和UCS中下調(diào)（P < 0.05）（圖2B）。GEPIA2的數(shù)據(jù)集顯示PAAD和SKCM與腫瘤分期顯著相關(guān)（P < 0.05）。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)集分析的結(jié)果，TPM4在BLCA、BRAC、CHOL、COAD、ESCA、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、PRAD、STAD和UCEC的腫瘤組織和配對(duì)正常組織中表達(dá)差異顯著（圖2C）。觀察到TPM4在肌動(dòng)蛋白絲（圖2D）和細(xì)胞質(zhì)（圖2E、F）中的亞細(xì)胞定位。因此，作者的結(jié)果表明TPM4在大多數(shù)腫瘤中上調(diào)，并且在STAD中高于配對(duì)（非配對(duì)）正常組織的表達(dá)水平。

圖2 TPM4的表達(dá)水平和定位

2. TPM4表達(dá)與泛癌預(yù)后和診斷的相關(guān)性

根據(jù)森林圖和Cox評(píng)估的結(jié)果（圖3A），TPM4是ACC、CESC、CHOL、DLBC、ESCC、HNSC、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、MESO、PAAD、STAD、UCEC和UVM的總體生存不良因素（P < 0.05，HR > 1），而在COAD、COADREAD、OS和PCPG中可能是有益因素（P < 0.05，HR < 1）。此外，作者重點(diǎn)關(guān)注TPM4表達(dá)與消化系統(tǒng)惡性腫瘤的關(guān)聯(lián)，TPM4高表達(dá)與LIHC（圖3D，p = 0.02）、ESCC（圖3E，p = 0.028）、PAAD（圖3F，p < 0.001）和STAD（圖3G，p = 0.018）的不良預(yù)后顯著相關(guān)。值得注意的是，在COAD（圖3B，p = 0.04）和COADREAD（圖3C，p = 0.009）的情況下，低TPM4表達(dá)的患者預(yù)后比高TPM4表達(dá)的患者更差。接下來(lái)，作者使用ROC曲線評(píng)估TPM4在消化系統(tǒng)癌癥的診斷效能。TPM4在預(yù)測(cè)COAD（AUC = 0.807）（圖3H）、COADREAD（AUC = 0.837）（圖3I）、ESCA（AUC = 0.725）（圖3J）、LICH（AUC = 0.739）（圖3K）和STAD（AUC = 0.795）（圖3L）方面具有一定的準(zhǔn)確性。TPM4表達(dá)在預(yù)測(cè)PAAD（AUC = 0.972)（圖3M）?？偟膩?lái)說(shuō)，TPM4的表達(dá)在不同的癌癥中，包括胃腺癌，在診斷和預(yù)后方面具有價(jià)值。

圖3 TPM4表達(dá)與泛癌預(yù)后和診斷的相關(guān)性

3. 遺傳改變分析

作者在cBioPortal上調(diào)查了TPM4在泛癌遺傳變異。如圖4A所示，TPM4表達(dá)在來(lái)自2565名不同癌癥類(lèi)型患者的131個(gè)樣本中發(fā)生了變異，占樣本的5%。TPM4的突變率在32種癌癥類(lèi)型中觀察到，如圖4B所示。最高的突變率（>60%）在卵巢癌癥例中觀察到。在包括胃癌在內(nèi)的24種癌癥中沒(méi)有觀察到較高的突變率。在胃癌中，最常見(jiàn)的變異類(lèi)型是拷貝數(shù)變異（CNV）中的“突變”和“擴(kuò)增”。隨后，如圖4C所示，作者調(diào)查了TPM4中推測(cè)的拷貝數(shù)變異（CNA）與泛癌組織中TPM4 mRNA表達(dá)的相關(guān)性。在胃癌中，鑒定出了15個(gè)突變基因，它們?cè)赥PM4高/低表達(dá)群體的突變譜中。前5個(gè)基因是ABCA12、DOCK3、NALCN、PCDH17和KRAS（圖4D）。

圖4 基因改變分析

4. 基因改變分析

作者評(píng)估了TPM4在正常組織和19種癌癥組織中的啟動(dòng)子DNA甲基化水平。在BRCA、CHOL、COAD、ESCA、HNSC、LUAD、PCPG、PRAD、THYM和UCEC中，TPM4的甲基化水平較高。相反，在GBM、KIRC、LICH、PAAD、SARC、STAD、TGCT和THCA中，它的甲基化水平較低（圖5A）。隨后，根據(jù)MethSurv數(shù)據(jù)庫(kù)中TPM4的甲基化圖譜，在STAD中確定了25個(gè)TPM4的CpG位點(diǎn)（圖5B）。此外，mRNA修飾參數(shù)是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，參與了轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控。許多研究表明，mRNA修飾與癌癥的進(jìn)展和發(fā)生密切相關(guān)。m1A、m5C和m6A是常見(jiàn)的mRNA修飾類(lèi)型。為了探索TPM4表達(dá)與45個(gè)mRNA修飾調(diào)節(jié)因子之間的相關(guān)性，選擇了甲基轉(zhuǎn)移酶（寫(xiě)入者）、去甲基酶（擦除者）和RNA結(jié)合蛋白（讀取者）。如圖6A-C所示，TPM4表達(dá)與大多數(shù)癌癥組織中的m1A、m5C和m6A甲基化呈正相關(guān)。隨后，在STAD中，前10個(gè)甲基化調(diào)控因子包括METTL14（m6A_writer; r=0.403, P < 0.0001）、YTHDF3（m1A_reader; r=0.421, P < 0.0001）、FTO（m6A_eraser; r=0.399）、TET2（m5C_eraser; r=0.375）、NSUN3（m5C_writer; r=0.374）、WTAP（m6A_writer; r= 0.368）、YTHDC2（m6A_reader; r=0.366）、CBLL1（m6A_reader; r=0.357）、FMR1（m6A_reader; r= 0.338）和YTHDC1（m1A_reader; r= 0.306）。以上結(jié)果表明，TPM4的表達(dá)與DNA甲基化和mRNA修飾在不同癌癥中密切相關(guān)，包括STAD。

圖5 TPM4的DNA甲基化分析

圖6 TPM4表達(dá)與mRNA修飾甲基化調(diào)控因子之間的相關(guān)分析

5. TPM4表達(dá)與免疫浸潤(rùn)

作者調(diào)查了TPM4表達(dá)與腫瘤微環(huán)境（TME）中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)聯(lián)。EPIC在線工具顯示，八種與TPM4表達(dá)在不同癌癥中相關(guān)的免疫細(xì)胞，尤其是在KIPR、LUAD、PCPG、PRAG、STAD和UVM中（圖7A）。ESTIMATE評(píng)分對(duì)于確定腫瘤純度和TME中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)非常有用。作者的研究結(jié)果顯示，TPM4表達(dá)與STAD中的ESTIMATE評(píng)分呈正相關(guān)（圖7B）。接下來(lái)，作者評(píng)估了TPM4高表達(dá)組和低表達(dá)組在STAD中CD8 T+細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和Treg細(xì)胞中的富集分?jǐn)?shù)。兩組之間的富集分?jǐn)?shù)顯示出顯著差異（圖7C）。免疫檢查點(diǎn)（ICP）基因被發(fā)現(xiàn)在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫治療結(jié)果中起到了作用。作者的結(jié)果表明，TPM4的表達(dá)與BRCA、CHOL、COAD、DLBC、ESCA、KICH、LGG、LIHC、LUAD、PAAD、PRAD、READ、STAD、THCA和UVM中這八個(gè)ICP基因（CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1、LG2和TIGIT）的表達(dá)呈正相關(guān)（圖7D）。這表明TPM4通過(guò)不同的信號(hào)通路協(xié)調(diào)ICP基因的活動(dòng)，并可能成為免疫治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。TMB、MSI和NEO被認(rèn)為是腫瘤免疫治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)因子。此外，作者觀察到TPM4的表達(dá)增加，并導(dǎo)致ACC、UCSC、GBM、PAAD和STAD中TMB的增加（圖7E）。MSI與TGCT、SARC、ACC、UVM和STAD中的TPM4表達(dá)呈正相關(guān)（圖7F）。TPM4的表達(dá)與ACC、TGTC、DLBC、PCPG和THCA中的NEO呈正相關(guān)（圖7G）?？傮w而言，TPM4可能通過(guò)與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞、ICPS、MSI、TMB和NEO在泛癌組織中的關(guān)聯(lián)來(lái)影響抗腫瘤免疫。

圖7 TPM4表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性分析

6. 在胃癌中構(gòu)建lncRNAs-miRNA-TPM4網(wǎng)絡(luò)

RNA22、DIANA-micro、miRWalk、miRcode和TargetScan被用于在STAD中識(shí)別TPM4的靶向miRNA，如圖8A所示。作者分別從這些來(lái)源中鑒定出了7、24、2063、10和1230個(gè)TPM4的靶向miRNA。在三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)出了41個(gè)共同的miRNA。為了進(jìn)一步探索這41個(gè)miRNA的靶向lncRNA，作者使用了Starbase2.0，并發(fā)現(xiàn)了七個(gè)miRNA（hsa-miR-613、hsa-miR-338-3P、hsa-miR-206、hsa-miR-30e-5P、hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-10b-5p和hsa-miR-299-3p）具有靶向lncRNA的能力。mRNA表達(dá)通常與miRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。TPM4表達(dá)與hsa-miR-30e-5P（圖8B）、hsa-miR-30b-5P（圖8C）、hsa-miR-338-3（圖8D）和hsa-miR-206表達(dá)（圖8E）呈負(fù)相關(guān)。lncRNA可以作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性miRNA進(jìn)一步調(diào)控mRNA表達(dá)。作者還確定了四個(gè)負(fù)調(diào)控的靶向miRNA及其靶向lncRNA（圖8F）。最后，作者構(gòu)建了一個(gè)GC的lncRNA-miRNA-TPM4調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖8G）。

圖8 在STAD中構(gòu)建與TPM4相關(guān)的關(guān)鍵ceRNA網(wǎng)絡(luò)

7. TPM4相關(guān)藥物的敏感性分析

CTPR數(shù)據(jù)集顯示了TPM家族成員（TPM1、TPM2、TPM3、TPM4）mRNA表達(dá)水平與藥物敏感性之間的相關(guān)性；與TPM4表達(dá)呈正相關(guān)的前三種藥物分別是COL-3（環(huán)素類(lèi)似物）、CR-1-31-B（eIF4A抑制劑）和GSK525762A（Bet抑制劑）；（圖9A；P < 0.0001）。根據(jù)GDSC藥物敏感性結(jié)果，與TPM4表達(dá)呈正相關(guān)的前三種藥物分別是5-氟尿嘧啶、AR-429（組蛋白去乙?；敢种苿┖虯T-7519（細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶抑制劑），與TPM4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的藥物分別是17-AAG（熱休克蛋白90抑制劑）、博萊霉素（50 uM）、CHIR-99021（GSK-3α/β抑制劑）、多西他賽（圖9C；P < 0.0001）。由于CTRP和GDSC藥物敏感性預(yù)測(cè)結(jié)果中涉及的一些藥物被用于科學(xué)研究，根據(jù)藥物庫(kù)的數(shù)據(jù)，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了基于TPM4相關(guān)數(shù)據(jù)的23種抗腫瘤藥物（圖9B）。作者使用CMap "qury"在線工具分析了TPM4高表達(dá)和低表達(dá)的差異表達(dá)基因（DEGs）。根據(jù)CMap數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)的結(jié)果，確定了包括ALK/BCR-ABL/BTK/CDK/Met抑制劑等在內(nèi)的15種小分子藥物，獲得了8種針對(duì)TPM4的小分子藥物，意味著它們具有治療前列腺腺瘤的潛力。UVM、LUAD、KIRC、COAD、BRCA、HCC。值得注意的是，Rucaparib的絕對(duì)值得分最高，意味著該藥物有治療7種癌癥的潛力（圖9E）。Rucaparib是一種聚(ADP-核糖)聚合酶（PARP）抑制劑，用于治療復(fù)發(fā)性卵巢和前列腺癌。

圖9 TPM4相關(guān)藥物在泛癌組織中的藥物敏感性

8. 相對(duì)共表達(dá)的基因，以及對(duì)TPM4在STAD中的功能分析

作者從TCGA中確定了表達(dá)共同性的基因。熱圖顯示了與STAD中TPM4表達(dá)呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的前50個(gè)共表達(dá)基因（圖10A、B）。與TPM4表達(dá)呈正相關(guān)的前100個(gè)共表達(dá)基因顯示在PPI網(wǎng)絡(luò)中（圖10C）。前10個(gè)中心基因是COL1A2、COL1A1、CLO3A1、COL5A、POSTN、FN1、MMP2、LUM、SPARC和DCN（圖10D）。前5個(gè)中心基因是COL1A2、CLO3A1、FN1、MMP2、LUM、SPARC和DCN（圖10E）。隨后，作者使用前300個(gè)共表達(dá)基因進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。GO分析涉及分子功能、細(xì)胞組分和生物過(guò)程（見(jiàn)圖10F）。KEGG通路富集分析（見(jiàn)圖10G）。結(jié)果顯示，TPM4表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)在胃癌中發(fā)揮作用。

圖10 相關(guān)基因顯示共表達(dá)，并對(duì)STAD中TPM4表達(dá)進(jìn)行功能分析

9. TPM4敲低抑制細(xì)胞遷移和腫瘤侵襲

為了驗(yàn)證TPM4在胃癌中的功能，作者在實(shí)驗(yàn)室中使用了兩種類(lèi)型的胃癌細(xì)胞。數(shù)據(jù)顯示了TPM4的mRNA（圖11A）和蛋白表達(dá)水平（圖11B）。在作者之前的研究中，經(jīng)過(guò)shRNA慢病毒感染后，shTPM4的沉默效率為71.1%，TPM4的沉默抑制了胃癌細(xì)胞的增殖。在這項(xiàng)研究中，作者使用劃痕愈合和Transwell實(shí)驗(yàn)來(lái)確定胃癌細(xì)胞的遷移潛力。TPM4的沉默抑制了AGS（圖11C，P < 0.01）和BGC-823（圖11D，P < 0.01）的遷移，這在劃痕愈合實(shí)驗(yàn)中觀察到。作者還發(fā)現(xiàn)TPM4的表達(dá)抑制了AGS細(xì)胞（圖11E，P < 0.01）和BGC-823細(xì)胞（圖11F，P < 0.01）的遷移。Matrigel Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，在TPM4沉默的情況下，AGS細(xì)胞（圖11G，P < 0.01）和BGC-823細(xì)胞（圖11H，< 0.01）的侵襲潛力顯著降低。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，TPM4是一個(gè)促進(jìn)胃癌腫瘤侵襲和細(xì)胞遷移的關(guān)鍵癌基因。

圖11 TPM4的敲低抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲能力

總結(jié)

TPM4在癌癥中，包括胃癌，作為一個(gè)有前景的預(yù)后和診斷和免疫治療的生物標(biāo)志物。此外，TPM4表達(dá)與多西他賽和5-氟尿嘧啶敏感性相關(guān)。lncRNA-miRNA-TPM4網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)胃癌進(jìn)展的機(jī)制。TPM4作為一個(gè)癌基因和促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的調(diào)節(jié)因子，可能通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)重塑，需要進(jìn)一步研究。