目前，全球至少有5000萬(wàn)癡呆患者，預(yù)計(jì)到2050年，將達(dá)1.52億，其中約60%-70%為阿爾茨海默病患者。阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD），亦俗稱(chēng)為老年癡呆癥，臨床上以認(rèn)知功能衰退、記憶損傷為主要表現(xiàn)，是一種中樞的神經(jīng)退行性疾病。近年來(lái)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)迅猛發(fā)展，在基礎(chǔ)科學(xué)研究和人類(lèi)疾病治療靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)上展現(xiàn)出巨大的潛力。長(zhǎng)期以來(lái)，基因編輯工具CRISPR一直被視為科學(xué)家彈藥庫(kù)中不可或缺的制勝法寶，且被評(píng)估為研究和治療AD的寶貴工具，主要應(yīng)用于AD模型構(gòu)建、致病基因篩選和靶向治療等方面。截至目前，已有較多的研究聚焦于基因編輯技術(shù)CRISPR實(shí)現(xiàn)對(duì)AD的深入研究，本文精選了近年來(lái)使用基因編輯技術(shù)在AD方面的研究，供大家學(xué)習(xí)與討論。

(1)CRISPR/Cas9 editing of APP C-terminus attenuates β-cleavage and promotes α-cleavage（Nature communications，IF=14.9196（2021））

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是一種潛在的疾病治療工具，但依賴于使用CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因刪除或突變校正的方法在實(shí)用性和范圍上受到限制。首先，整個(gè)基因的刪除肯定會(huì)對(duì)生理產(chǎn)生有害作用，這些基因通常也具有正常的生理作用；其次，旨在糾正點(diǎn)突變的策略僅適用于一小部分遺傳的神經(jīng)退行性疾?。ㄍǔ?lt; 10％的病例），在神經(jīng)退行性疾病模型中的應(yīng)用有所限制。基于此，美國(guó)威斯康星大學(xué)Krishanu Saha與Subhojit Roy研究員合作，使用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)淀粉樣前體蛋白（APP）C-端編輯來(lái)減少AD中APP-β的裂解以及Aβ的產(chǎn)生，提供一種通過(guò)基因編輯操縱淀粉樣蛋白干預(yù)AD進(jìn)程的治療策略。

在這項(xiàng)研究中，研究人員在細(xì)胞和動(dòng)物模型中引入了一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)的策略，通過(guò)選擇性編輯內(nèi)源性淀粉樣前體蛋白（APP）C末端序列以實(shí)現(xiàn)對(duì)淀粉樣蛋白生成途徑的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，這種編輯在人類(lèi)?iPSC衍生神經(jīng)元細(xì)胞中改變APP的裂解平衡，減少APP-β的裂解以及Aβ的生成，同時(shí)上調(diào)具有神經(jīng)保護(hù)性的APP-α裂解。進(jìn)一步的，在分析基因編輯可能的脫靶效應(yīng)中發(fā)現(xiàn)：APP N末端和代償性APP同系物保持完整，對(duì)體外神經(jīng)生理學(xué)沒(méi)有明顯影響；在人類(lèi)?iPSC衍生神經(jīng)元細(xì)胞及小鼠腦中均未檢測(cè)到任何的脫靶效應(yīng)。最后，為了闡釋此次基因編輯對(duì)于APP?β/α調(diào)控機(jī)制，研究人員使用AAV9s進(jìn)行小鼠海馬體的體內(nèi)注射，提出這種基因編輯策略可能通過(guò)限制APP/BACE-1在物理上的趨近來(lái)起到調(diào)控APP?β/α裂解。

(2)Gene expression and functional deficits underlie TREM2-knockout microglia responses in human models of Alzheimer’s disease（Nature communications，IF=14.9196（2020））

TREM2作為一種髓系特異性AD風(fēng)險(xiǎn)基因的發(fā)現(xiàn)，加速了對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞在AD中作用的研究。雖然利用TREM2小鼠模型進(jìn)行研究已提供了許多重要見(jiàn)解，但TREM2在人類(lèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中的正常和疾病相關(guān)功能仍不清楚。為了進(jìn)一步探究TREM2對(duì)人類(lèi)疾病的影響，來(lái)自加利福尼亞大學(xué)爾灣分校的Mathew Blurton-Jones教授團(tuán)隊(duì)對(duì)人類(lèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM2的功能進(jìn)行了研究，并在Nature Communications國(guó)際著名雜志上發(fā)表了該研究成果。

為了揭示TREM2在人類(lèi)疾病中的相關(guān)功能，研究人員分析了從TREM2敲除誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（iPSC）系分化的小膠質(zhì)細(xì)胞。通過(guò)將轉(zhuǎn)錄組學(xué)和功能分析與嵌合AD小鼠模型相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)TREM2的缺失會(huì)降低小膠質(zhì)細(xì)胞存活率，損害包括載脂蛋白E在內(nèi)的關(guān)鍵疾病相關(guān)底物的吞噬功能，并抑制SDF-1α/CXCR4介導(dǎo)的趨化性，最終導(dǎo)致體內(nèi)對(duì)β-淀粉樣斑塊的反應(yīng)受損。進(jìn)一步的，通過(guò)對(duì)異種移植人小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)人類(lèi)TREM2基因敲除小膠質(zhì)細(xì)胞中疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞（DAM）反應(yīng)有所缺失，并且在流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)?？傊@一系列的研究發(fā)現(xiàn)揭示了TREM2在人類(lèi)疾病方面的保守和新穎性功能，深入了解了對(duì)人類(lèi)小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM2的正常和疾病相關(guān)功能，表明TREM2可能在AD的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。

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(3)Repression of phagocytosis by human CD33 is not conserved with mouse CD33（Communications biology，IF=?6.268（2019））

CD33是一種免疫調(diào)節(jié)受體，通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用，與阿爾茨海默病?(AD)?易感性相關(guān)。人CD33 (hCD33)?和鼠CD33 (mCD33)?之間的結(jié)構(gòu)特征差異在于：mCD33中具有獨(dú)特的跨膜賴氨酸，而hCD33中獨(dú)特的細(xì)胞質(zhì)酪氨酸。然而，這種結(jié)構(gòu)差異所引起的抑制吞噬功能差異尚不清楚。一項(xiàng)刊登在國(guó)際雜志Communications Biology上的研究報(bào)告中，來(lái)自加拿大阿爾伯塔大學(xué)等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：mCD33和?hCD33在調(diào)節(jié)吞噬作用中具有不同的作用；此外，他們還開(kāi)發(fā)了一種在小膠質(zhì)細(xì)胞系中表達(dá)hCD33的新轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為探索hCD33與淀粉樣斑塊積聚之間的聯(lián)系提供了合適的小鼠模型。

在這一具體的研究中，研究人員使用新的αmCD33單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)mCD33在中性粒細(xì)胞上高表達(dá)，而在小膠質(zhì)細(xì)胞上低表達(dá)。值得注意的是，mCD33在細(xì)胞表面表達(dá)完全依賴于?Dap12，這種依賴作用是靠Dap12與mCD33中跨膜賴氨酸的相互作用來(lái)維系。在RAW264.7巨噬細(xì)胞、BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞、原發(fā)性新生兒和成人小膠質(zhì)細(xì)胞中，mCD33基因敲除后細(xì)胞對(duì)外源物的吞噬（包括聚集的?Aβ1-42）作用沒(méi)有任何改變。但是，在高表達(dá)hCD33的人單核吞噬細(xì)胞系（THP-1及?U937細(xì)胞）中，hCD33基因的敲除卻增加了細(xì)胞對(duì)外源物的吞噬作用。此外，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞譜系中表達(dá)hCD33的轉(zhuǎn)基因小鼠的原代小膠質(zhì)細(xì)胞中表現(xiàn)出對(duì)外源物的吞噬的抑制作用。因此，mCD33和?hCD33在調(diào)節(jié)吞噬作用中具有不同的作用，突出了研究hCD33在AD易感性的重要性。

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