人前列腺癌細(xì)胞LNCaP Clone FGC，是1977年從一位50歲白人男性（血型B+）的左鎖骨淋巴結(jié)針刺活檢中分離的，當(dāng)時該患者已確診為轉(zhuǎn)移性前列腺癌。根據(jù)報道，該細(xì)胞對5-α-二氫睪酮（生長調(diào)節(jié)并生成酸性磷酸酶ACP）有響應(yīng)。

那如何養(yǎng)好LNCaP Clone FGC 呢？小普今天來為你們詳細(xì)講解。

培養(yǎng)注意事項

01?該細(xì)胞并不形成一致的單層，而是形成集落；

02?該細(xì)胞會使培養(yǎng)基快速變酸，且生長緩慢，故傳代后 48 小時內(nèi)不應(yīng)擾動；

03?普通TC處理的培養(yǎng)瓶或皿不能使細(xì)胞很好的貼壁，培養(yǎng)難度較高，需使用 Corning 的 cellbind 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，或者使用多聚-L-賴氨酸溶液 包被過的培養(yǎng)皿；

04?在細(xì)胞運輸途中，多數(shù)細(xì)胞會從培養(yǎng)瓶底分離，大片懸浮在培養(yǎng)基中，按照收貨注意事項處理即可恢復(fù)正常。

收貨處理方式

收貨后，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞漂浮或成團，可按下面的步驟進(jìn)行處理：

01?將培養(yǎng)瓶內(nèi)的所有培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入無菌離心管，離心收集細(xì)胞（1200rpm 3min）；

02?去掉上清，用PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞收集到一個離心管中，PBS震動離心管混勻即可，再次離心（1200rpm 3min）；

03?去掉上清，加入1ml左右0.25%胰酶，重懸混勻細(xì)胞。震動離心管，混勻即可，不能吹打。放入培養(yǎng)箱，消化細(xì)胞，消化時間3分鐘左右；

04?消化完畢后，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞團分散。加入5ml含血清的培養(yǎng)基，混勻后終止消化，離心（1200rpm 3min）；

05?去掉上清，加入5-7ml相應(yīng)完全培養(yǎng)基混勻，輕輕/反復(fù)吹打細(xì)胞，接種于無菌T25瓶中（接種容器應(yīng)提前用對應(yīng)培養(yǎng)基浸潤）。

傳代步驟

01?吸出原培養(yǎng)液；

02?加入2ml左右PBS，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，潤洗細(xì)胞，吸出PBS，丟棄；

03?加入1ml左右胰酶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使之浸潤所有細(xì)胞；

04?放入培養(yǎng)箱消化，消化5分鐘左右，顯微鏡下可看到，細(xì)胞塊中間的細(xì)胞明顯分離變圓，且自然脫落（全程不要拍打培養(yǎng)瓶）；

05?加入3ml含血清的培養(yǎng)基，終止消化，輕輕/反復(fù)吹打細(xì)胞，在顯微鏡下觀察。細(xì)胞懸液中，細(xì)胞盡量為單個狀態(tài)；

06?收集細(xì)胞懸液，離心（1200rpm 3min）。離心完，吸出上清，丟棄；

07?加入新鮮培養(yǎng)基，吹打幾下，混勻細(xì)胞即可。按需接種到新培養(yǎng)瓶，補充足量培養(yǎng)基，擰松瓶蓋，或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng)；

08?檢查培養(yǎng)箱的二氧化碳、溫度及水盤。

傳代比例和頻次

推薦1:2~1:4傳代，每4~5天傳代一次。

換液步驟

吸出舊培養(yǎng)基，沿培養(yǎng)瓶側(cè)邊加入新培養(yǎng)基；

每3天換液一次。

凍存步驟

01?配置凍存液。推薦配比：55%（基礎(chǔ)培養(yǎng)基1640）+40%(血清)+5%（DMSO）；

02?DMSO配置時會放熱，一定要等凍存液冷卻后再使用，避免灼傷細(xì)胞；

03?細(xì)胞消化好后用新鮮培養(yǎng)基中止，制成細(xì)胞懸液；

04?1200rpm 3min 離心后去上清，盡量吸干凈上清；

05?加入配置好的凍存液，重懸，建議一個T25長滿凍存1支，或者細(xì)胞計數(shù)后，按照2-5×106cells/支的比例凍存；

06?將分裝好的凍存液轉(zhuǎn)入程序凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；

07?從-80℃冰箱取出凍存管，迅速轉(zhuǎn)移到液氮，長期保存。

復(fù)蘇步驟

01?將水浴鍋預(yù)熱至37℃，準(zhǔn)備好干凈的一次性手套，向一個無菌離心管內(nèi)，加入9ml無菌培養(yǎng)基；

02?將細(xì)胞從液氮罐中取出，放入一次性手套中，迅速沒入水浴鍋。搖晃凍存管加速溶解，以1分鐘內(nèi)全部溶解為宜；

03?在超凈臺中，將復(fù)蘇好的細(xì)胞液，加入到裝有新鮮培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，1200rpm/min離心3分鐘，離心完畢，去掉上清；

04?用適量與細(xì)胞對應(yīng)的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接入到無菌容器（培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿）中，補充一定量培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

05?溶解過程要迅速，已溶解的凍存細(xì)胞不能在常溫下存放太久，需盡快離心去除DMSO。

參考文獻(xiàn)：?[1].https://www.cellbank.org.cn/cellbank_upload/20191204161104_6905.pdf

來源：“武漢普諾賽”公眾號，作者~小普。
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