作者：Velin Z. Spassov （BIOVIA DASSAULT SYSTEMES）

本文簡要介紹了最近在BIOVIA Discovery Studio?中實(shí)現(xiàn)的兩種計(jì)算機(jī)模擬方法，用于評估蛋白質(zhì)的溶解度及其在生物制品(包括抗體)工程中的實(shí)用性。

介紹

工程生物制劑時要考慮的最重要的特性之一是蛋白質(zhì)溶解度。 由于生產(chǎn)中的低表達(dá)或純化、降解、儲存和/或給藥方面的問題，溶解性差會影響產(chǎn)量。

在這里，我們概述了兩種基于物理的蛋白質(zhì)溶解度計(jì)算方法。兩種模型均基于現(xiàn)有 BIOVIA Discovery Studio (DS)組件執(zhí)行的組合 CHARMm GBIM分子力學(xué)和蛋白質(zhì)電離計(jì)算，以評估轉(zhuǎn)移自由能 (ΔGtr )[4] 在液相和凝相之間。 一般來說，蛋白質(zhì)聚集是一個多階段過程，從形成不同大小的寡聚體開始，如二聚體、三聚體等。我們可以假設(shè)在飽和狀態(tài)下，凝聚相由相對較大的結(jié)晶顆粒組成。然后，我們可以用蛋白質(zhì)分子對晶格表面的結(jié)合能（ΔGbnd）來近似轉(zhuǎn)移自由能ΔGtr，它可以用蛋白質(zhì)溶解度來表示，ΔGbnd=RTln（S）（圖1）。

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理論

第一種方法基于新的結(jié)合親和力溶解度模型（BSM），其中通過直接計(jì)算蛋白質(zhì)與晶格的結(jié)合親和力來評估蛋白質(zhì)溶解度。 據(jù)我們所知，BSM 模型在文獻(xiàn)中沒有類似物。雖然評估完整晶格能量是不現(xiàn)實(shí)的，但我們首次提出了一種近似值，其中晶格由被其直接相鄰晶體包圍的中心蛋白質(zhì)分子表示（圖1）。使用 DS的Create Crystal Neighbors協(xié)議，我們生成了模型粒子的原子坐標(biāo)。 基于模型晶體顆粒，我們使用Calculate Mutation Energy (Binding)方案評估了 pH 依賴性和突變對蛋白質(zhì)溶解度的影響。結(jié)合能通過與 pH 無關(guān)以及與 pH 相關(guān)的靜電項(xiàng)的總和來計(jì)算，兩者都被認(rèn)為是蛋白質(zhì)分子結(jié)合親和力的主要貢獻(xiàn)者。

與 pH 無關(guān)的項(xiàng)包括由 CHARMm 模塊計(jì)算的范德華和熵貢獻(xiàn)，靜電項(xiàng)是使用與Calculate Protein Ionization and Residue pK協(xié)議中相同的方法推導(dǎo)的。第二種方法基于經(jīng)驗(yàn)溶解度模型 (ESM)，該模型是為快速排列大量蛋白質(zhì)變體的溶解度而開發(fā)的。 我們在Calculate Protein Formulation Properties協(xié)議中實(shí)施了 ESM 模型。 在 ESM 模型中，我們通過經(jīng)驗(yàn)評分函數(shù)估計(jì) pH 和突變對溶解度的影響（圖 2）。

蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力與pH依賴性蛋白質(zhì)凈電荷平方αZ2成正比；由電荷不對稱引起的靜電引力用偶極矩平方 -βD2 來近似；溶劑化貢獻(xiàn)計(jì)算為凝聚相和溶液相之間的溶劑化能差 ΔGslv。 我們假設(shè)非極性相互作用，例如范德華引力，與疏水表面斑塊成正比，并且我們通過疏水聚集傾向得分 AS 來近似它們，該得分是按照 Chennamsetty 等人的方法計(jì)算的。并在Calculate Protein Formulation Properties協(xié)議中實(shí)施，其中系數(shù)α、β、γ和C是經(jīng)驗(yàn)參數(shù)。

結(jié)果和討論

我們最初使用 Shaw 等人發(fā)表的研究中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測試了 ESM 和 BSM 方法預(yù)測溶解度的 pH 依賴性的能力。該研究的重點(diǎn)是 RNase SA 及其3K和5K突變體的溶解度，兩種方法都很好地預(yù)測了溶解度的 pH 依賴性，特別是 5K 突變體溶解度的重要 pH 形狀（圖2）。 此外，在 RNase SA 計(jì)算中使用相同的 ESM 參數(shù)，我們實(shí)現(xiàn)了鋅-胰島素實(shí)驗(yàn) pH 溶解度的良好擬合。

除了模擬蛋白質(zhì)溶解度的 pH 形狀之外，BSM 和 ESM 方法還用于預(yù)測突變對蛋白質(zhì)溶解度的影響，以用于蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)。 使用 RNase SA 上的 21 個單突變的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了初步測試，包括 Thr76 突變?yōu)樗邪被犷愋汀?BSM 和 ESM 方法都顯示出與實(shí)驗(yàn)值的強(qiáng)相關(guān)性，皮爾遜相關(guān)系數(shù)R分別為 0.90 和 0.92（圖 3）。 然而，值得注意的是，BSM 結(jié)果是在沒有對自由能函數(shù)進(jìn)行任何調(diào)整的情況下獲得的，并且計(jì)算使用完全相同的Calculate Mutation Energy (Binding)協(xié)議參數(shù)運(yùn)行，就像我們之前對蛋白質(zhì)結(jié)合親和力和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究。

此外，我們將 ESM 方法應(yīng)用于 122 個具有單突變、雙突變和多突變的蛋白質(zhì)，這些突變來自 Tian 等人發(fā)布的數(shù)據(jù)集。目的是評估 ESM 方法預(yù)測這些突變導(dǎo)致的溶解度變化的能力，無論實(shí)驗(yàn)方法或聚集機(jī)制如何。

總之，該方法正確預(yù)測了突變的影響（提高或降低溶解度），122 例中有 95 例 (78%)。 有趣的是，當(dāng)我們考慮到蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的變化并假設(shè)不穩(wěn)定突變超過 4.0 kcal/mol 將降低溶解度時，預(yù)測率已增加到 122 個突變中的 107 個（88%）。 為此，我們通過 pH 依賴模式下的Calculate Mutation Energy (Stability)方案計(jì)算了每個突變的折疊能量變化。 我們獲得的結(jié)果表明，大多數(shù)蛋白質(zhì)僅具有一定程度的穩(wěn)定性，折疊能量幾千卡/摩爾的變化可能會導(dǎo)致部分或完全解折疊； 因此，增加了聚集傾向，進(jìn)而降低了蛋白質(zhì)的溶解度。

考慮到對治療性抗體的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)的重大興趣，我們還進(jìn)行了ESM計(jì)算來預(yù)測溶解度，并將結(jié)果與5種不同抗體數(shù)據(jù)集的實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行了比較。它包括抗-IL-13抗體CNTO607的7種變體，靶向神經(jīng)生長因子(NGF)的單克隆抗體的9種不同變體，模型抗體mAb- J的11種變體,人源化抗三硝基苯抗體HzATNP的17種變體，VEGF結(jié)合G6合成mAb的11種變體。預(yù)測抗體溶解度的一個重要問題是，大多數(shù)可用的x射線結(jié)構(gòu)都是抗體片段，如Fab或Fv結(jié)構(gòu)域，而溶解度測量通常是在全長抗體上進(jìn)行的。因此，在本研究中，我們提出并測試了一種抗體導(dǎo)向的ESM評分函數(shù)(ESMab)變體，假設(shè)Fab或Fv片段的突變可以通過Fab - Fab和Fab - Fc相互作用來穩(wěn)定晶體狀態(tài)，并且適用于Fab和Fc結(jié)構(gòu)都可用的情況。參考文獻(xiàn)1的表9總結(jié)了抗體溶解度的ESM預(yù)測結(jié)果。ESM方法正確預(yù)測了67個突變變體中的53個(80%)的溶解度變化，每個抗體數(shù)據(jù)集的Pearson相關(guān)系數(shù)R在0.83和0.91之間。測試還表明，ESM結(jié)果的準(zhǔn)確性優(yōu)于其他方法，如CamSol、Tango和Solubis。

結(jié)論

蛋白質(zhì)的溶解度受蛋白質(zhì)分子之間以及與溶劑分子之間的相互作用的影響。在這項(xiàng)工作中提出的模型包括一些影響溶解度的最重要的相互作用，如靜電排斥和吸引，非極性相互作用，以及蛋白質(zhì)分子從液體轉(zhuǎn)移到結(jié)晶相的脫溶和熵懲罰。與大多數(shù)現(xiàn)有方法不同，BSM和ESM模型考慮了酸性和堿性氨基酸殘基的質(zhì)子化能。兩種方法都能以合理的準(zhǔn)確性預(yù)測pH值和突變對蛋白質(zhì)溶解度的影響。

由于蛋白質(zhì)大小的限制和需要晶體顆粒結(jié)構(gòu)，雖然不如ESM方法實(shí)用，但我們認(rèn)為BSM方法具有相當(dāng)大的理論價(jià)值，因?yàn)樗状巫C明了蛋白質(zhì)溶解度可以從完全物理的、基于力場的模型中推導(dǎo)出來，并為未來設(shè)計(jì)更有效的實(shí)現(xiàn)開辟了道路。

ESM方法在Calculate Protein Formulation Properties協(xié)議中實(shí)現(xiàn)，同時計(jì)算可發(fā)展性指數(shù)(DI)和粘度評分。它適用于快速篩選大量的設(shè)計(jì)變體?？贵w測試結(jié)果表明，溶解度預(yù)測具有良好的準(zhǔn)確性，并進(jìn)一步證明，ESM適用于具有改進(jìn)配方特性的新生物制劑工程或其他生物技術(shù)行業(yè)中使用的蛋白質(zhì)。

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