lgA 腎病動(dòng)物模型【北京動(dòng)物造模】

【造模機(jī)制】聯(lián)合應(yīng)用牛血清白蛋白、脂多糖和四氟化碳造成動(dòng)物胃腸道黏膜免疫功能紊亂和免疫系統(tǒng)對(duì)血液和腎小球中的多量 IRA清除障礙,致使腎小球系膜這以 IgA 為主的免疫復(fù)合物沉積,同時(shí)使系膜細(xì)胞增生,基質(zhì)增多,繼續(xù)發(fā)展動(dòng)物可出現(xiàn)尿蛋白和尿血等lgA 腎病時(shí)典型癥狀。

【選模方法】

1.動(dòng)物及分組選用清潔級(jí)雄性 SD 健康大鼠,體重為 220~260g,隨機(jī)分組。

2.模型制備采用復(fù)合改良法造模:運(yùn)用牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)十脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)+四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl.)方法建立實(shí)驗(yàn)性 IgA 腎病模型,方案如下:口服免疫原 BSA 劑量較常用劑量增加 1倍,400mg/kg 隔天灌胃,持續(xù) 6 周;CCL 注射方式由既往的腹腔注射改為皮下注射,用誘導(dǎo)肝纖維化劑量的 1/3(皮下注射蓖麻油 0.5ml+CCL 0.10ml,每周 1 次,持續(xù)」周).并聯(lián)合運(yùn)用 LPS(分別于第6.8 周以 LPS 0.05mg 尾靜脈注射)。正常對(duì)照組正常飲食和生活,不予干預(yù)。

3.樣本收集和指標(biāo)測(cè)定用代謝籠收集 24 小時(shí)尿,每3 周檢測(cè) 1 次 24 小時(shí)尿蛋白和尿常規(guī),直至第 10 周末。在造模的 10 周內(nèi),每天觀察有無(wú)肉眼血尿。分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第 1天、造模后第 10 周末從大鼠靜脈取血,用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè) ALT 和 AST、血清白蛋白、血清總蛋白、尿素氮及血肌酐。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取腎臟分成兩半,外圍的腎皮質(zhì)一部分冷凍切片.做免疫熒光 1gA 檢測(cè);另一部分做常規(guī)光鏡檢查。取高碘酸-希夫染色(PAS)的腎組織切片置于 200 倍光學(xué)顯微鏡下,每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù) 15 個(gè)腎小球,利用德國(guó) KONTR(NIBAS2.5 全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng),用鼠標(biāo)標(biāo)出腎小球系膜區(qū),計(jì)算面積,同時(shí)測(cè)出毛細(xì)血管叢面積,算出腎小球系膜區(qū)占整個(gè)毛細(xì)血管叢面積的百分比。采用國(guó)內(nèi)外通用的半定量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腎組織進(jìn)行免疫熒光強(qiáng)度分級(jí)。

【模型特點(diǎn)】采用復(fù)合改良法造模,全部大鼠均出現(xiàn)蛋白尿,其中 70%出現(xiàn)肉眼血尿,30%出現(xiàn)鏡下血尿,免疫熒光顯示腎組織 IgA 強(qiáng)度(2t≤3*),光鏡 PAS 染色顯示有彌漫性的輕中度系膜區(qū)增生,血白蛋白(ALB)水平較正常對(duì)照組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),轉(zhuǎn)氨酶較正常對(duì)照組沒(méi)有升高。復(fù)合改良法造模的優(yōu)點(diǎn)：

1.聯(lián)合應(yīng)用 LPS+RSA+CCL作為造模方法 LPS 是免疫佐劑,毒性較外毒素葡萄球菌腸毒素弱,不易對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成損害,引起動(dòng)物死亡。

2.將口服免疫原 BSA 的劑量比既往加大 1 倍改為 400mg/kg,隔日1次。

3.CCL 由以往的腹腔注射改為皮下注射且劑量減少至誘導(dǎo)肝纖維化劑量的 1/3.盡可能減少對(duì)肝臟的損害,CCL常規(guī)誘導(dǎo)肝纖維化的劑量為 50%(體積比)。通過(guò)以上改良,模型組 IgA 在腎臟組織有較強(qiáng)沉積,操作起來(lái)更方便和安全,不易引起腹腔感染和動(dòng)物死亡,并且無(wú)明顯肝臟損害。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,改良造模組大鼠無(wú) 1 例死亡,除了臨床檢測(cè)指標(biāo)(蛋白尿,血尿)取得比較滿意的結(jié)果外,病理方面也較為理想,全部造模大鼠腎臟系膜區(qū)都出現(xiàn)以較強(qiáng)的 IgA 沉積為主的病變。

【應(yīng)用范圍】研究 IgA 腎病的發(fā)病機(jī)制和治療方法。

【注意事項(xiàng)】

1.應(yīng)嚴(yán)格按 LPS+BSA+CCI組合方法、給藥劑量,方法造模。

2. CCI,劑量不能增大,不然會(huì)造成肝臟功能?chē)?yán)重?fù)p害,降低造模成功率。

【模型評(píng)估】IgA 腎病是最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球疾病,約占原發(fā)性腎小球疾病的 1/3。采用復(fù)合改良法造模,是目前 IgA 腎病中較為可靠、穩(wěn)定、成功率高,且病理、臨床指標(biāo)接近人類(lèi) IgA 腎病的動(dòng)物模型。它克服了口服免疫源十肝臟切除十免疫佐劑復(fù)合造模法動(dòng)物死亡率高(約50%)的缺點(diǎn);葡萄球菌腸毒素十口服免疫源十免疫佐劑復(fù)合造模法因葡萄球菌腸毒素是外毒素,毒性大,易引起機(jī)體損害;腹腔注射 CCI,引發(fā)的 IgA 腎病模型,雖然有高強(qiáng)度的 IgA 沉積,但肝臟功能損害嚴(yán)重,常伴有肝細(xì)胞壞死、變性和假小葉生成。但嚙齒類(lèi)動(dòng)物復(fù)制的 IgA 腎病模型,其血清 IgA 特性與人類(lèi)存在較大差別,有望建立基因工程模型來(lái)克服其不足,因此,建立更新、更方便、更貼近人類(lèi)特點(diǎn)的 IgA 腎病動(dòng)物模型仍是我們共同的研究任務(wù)。

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