細(xì)胞培養(yǎng)是指細(xì)胞在體外的培養(yǎng)技術(shù)，即在無菌條件下，從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)正常生理狀態(tài)下生存的基本條件，讓它在培養(yǎng)皿中繼續(xù)生存、生長和繁殖的方法。通過細(xì)胞培養(yǎng)我們可以獲得大量的、性狀相同的細(xì)胞，以便于研究細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及功能和機(jī)制。然而想讓細(xì)胞平安健康的“長大”卻絕非易事，趕緊跟著小編一起來學(xué)習(xí)細(xì)胞培養(yǎng)秘籍吧！本文將為大家介紹細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作步驟、培養(yǎng)基成分及類型和細(xì)胞污染分類及處理方法。

細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟

PART?01

細(xì)胞培養(yǎng)又具體分為細(xì)胞傳代、換液、凍存、復(fù)蘇等一系列過程，每個(gè)步驟都對(duì)應(yīng)著不同的操作技術(shù)要點(diǎn)，想要養(yǎng)好細(xì)胞，每一步都必須掌握。

（1）細(xì)胞傳代（貼壁細(xì)胞）

試劑：PBS，胰酶，含血清的培養(yǎng)基

流程：當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80-90%時(shí)需要進(jìn)行傳代操作，先吸出原培養(yǎng)液，再加入PBS輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶潤洗細(xì)胞，吸出PBS丟棄；接下來加入胰酶放入培養(yǎng)箱消化，消化時(shí)間因細(xì)胞而異，顯微鏡下觀察確定是否消化完全；之后加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞使之脫落并在液體里反復(fù)吹打使細(xì)胞，使之盡量呈單顆細(xì)胞的懸浮液，收集細(xì)胞懸液離心，離心完吸出上清丟棄；加入新鮮培養(yǎng)基，吹打幾下混勻細(xì)胞，按需接種到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)即可。

（2）細(xì)胞換液

試劑：PBS，含血清的培養(yǎng)基

流程：先吸出原培養(yǎng)液，再加入PBS輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶潤洗細(xì)胞，吸出PBS丟棄，最后加入新鮮的含血清的培養(yǎng)基，放到孵箱繼續(xù)培養(yǎng)即可。

（3）細(xì)胞凍存

試劑：凍存液， PBS，胰酶，含血清的培養(yǎng)基

流程：按無血清培養(yǎng)基：血清：DMSO =7：2：1提前配置凍存液，置于室溫備用；從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞制成懸液，離心后吸掉上清液，加入凍存液，輕輕吹吸均勻，每管等量1ml裝入凍存管；嚴(yán)密封口后，進(jìn)行程序性降溫凍存：－4 ℃ 30 分鐘，20 ℃ 30 分鐘，﹣80 ℃過夜，最后進(jìn)行液氮保存。

（4）細(xì)胞復(fù)蘇

試劑：含血清的培養(yǎng)基

流程：從液氮中取出凍存管，迅速（小于3min）置于37°C水浴鍋中；解凍時(shí)，邊晃動(dòng)邊觀察，當(dāng)看到只有一小塊冰存在時(shí)，即可從水浴鍋中取出；打開凍存管，迅速將細(xì)胞懸液吸到離心管中，輕輕混勻，1000r/min，離心五分鐘，吸掉上清液；沉淀中加入適量培養(yǎng)液，放入孵箱中，培養(yǎng)。復(fù)蘇的細(xì)胞，需要在24小時(shí)后，換一次培養(yǎng)液。

培養(yǎng)基成分及類型

PART?02

細(xì)胞傳代、凍存或是復(fù)蘇這些步驟都離不開培養(yǎng)基，培養(yǎng)基是微生物學(xué)和生命科學(xué)中常見的實(shí)驗(yàn)室試劑，也被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程等領(lǐng)域。培養(yǎng)基中包含多種營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的生長、分裂和代謝起著重要的作用。接著我們將詳細(xì)介紹培養(yǎng)基中的各種成分和培養(yǎng)基的類型。

（1）培養(yǎng)基成分

（2）培養(yǎng)基類型

① MEM培養(yǎng)基

MEM是一種最基礎(chǔ)、最常用的細(xì)胞培養(yǎng)基，僅含有12種必需氫基酸、L-谷氫酰胺和8種維生素，含糖量為1g/L，主要應(yīng)用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)，在添加血清后，可用于培養(yǎng)多種單層生長的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞。

② DMEM培養(yǎng)基

氮基酸含量是MEM的兩倍，維生素含量是MEM的4倍，以及硝酸鐵、丙酮酸鈉和一些補(bǔ)充氫基酸。此外，DMEM分為低糖型和高糖型，葡萄糖含量分別為Ig/L和4.5g/L. （低糖適于依賴性貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，特別適用于生長速度快、附著性較差的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)；高糖更適合高密度懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，也適用于附著性較差，但又不希望它脫離原來生長點(diǎn)的克隆培養(yǎng)。）

③ RPMI-1640

廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物、特殊造血細(xì)胞、正?；驉盒栽錾陌准?xì)胞，雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，是目前應(yīng)用十分廣泛的培養(yǎng)基。主要用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞以及HCT-15上皮細(xì)胞等均可參考使用。

④ DMEM/F12：F12

培養(yǎng)基成分復(fù)雜，含有多種微量元素，和DMEM以1：1結(jié)合，稱為DMEM/F12培養(yǎng)基。由于F12含有較豐富的成分和DMEM含有較高濃度的營養(yǎng)成分，可作為開發(fā)無血清配方的基礎(chǔ)。該培養(yǎng)基適用于血清含量較低條件下哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。此外，還在DMEM/F12中加入15mM HEPES緩沖液，增強(qiáng)了該培養(yǎng)基的緩沖能力。

⑤ McCoy 5A培養(yǎng)基

可支持多種（如骨髓、皮膚、肺和脾臟等）的原代移植物的生長，除適于一般的原代細(xì)胞培養(yǎng)外，主要于作組織活檢培養(yǎng)、一些淋巴細(xì)胞培養(yǎng)以及一些難培養(yǎng)細(xì)胞的生長支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纖維細(xì)胞、人淋巴細(xì)胞、HT-29、BHL-100等上皮細(xì)胞。

⑥ IMDM培養(yǎng)基

此培養(yǎng)基不含鐵，使用硝酸鉀取代硝酸鐵，還添加了硒和其他氨基酸及維生素。非常適用于快速增殖的高密度細(xì)胞培養(yǎng)，包括Jurkat、COS-7 和巨噬細(xì)胞。IMDM還能夠促進(jìn)小鼠B淋巴細(xì)胞，LPS刺激的B細(xì)胞，骨髓造血細(xì)胞，T細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞的生長。

⑦ M-199 培養(yǎng)基

起初開發(fā)用于雞胚成纖維細(xì)胞的營養(yǎng)研究，后廣泛用于病毒學(xué)、疫苗生產(chǎn)以及小鼠胰腺上皮和大鼠晶狀體組織原代外植體的體外培養(yǎng)。它具有廣泛的物種適用性，特別適用于非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)。與其他基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，199培養(yǎng)基含有獨(dú)特的成分，包括腺嘌呤、腺苷、次黃嘌呤、胸腺嘧啶和其他維生素。

⑧ L-15培養(yǎng)基

L-15培養(yǎng)基支持HEP-2猴腎臟細(xì)胞以及胚胎和成人組織的原代組織塊生長。采用磷酸鹽和游離氨基酸而非碳酸氫鈉進(jìn)行緩沖。適用于快速增殖瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，用于在CO2缺乏的情況下培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞株。此培養(yǎng)液采用磷酸鹽緩沖體系，氨基酸組成進(jìn)一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖。

細(xì)胞污染分類及處理

PART?03

除了學(xué)會(huì)為我們的細(xì)胞選擇合適的培養(yǎng)基，并且熟練掌握細(xì)胞傳代、復(fù)蘇等技術(shù)，預(yù)防細(xì)胞污染也是重中之重。本期最后我們來細(xì)說下細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的一些污染現(xiàn)象及處理方法。

一 、 細(xì)菌污染

特征：細(xì)菌大小在0.5~5 um，比動(dòng)物細(xì)胞小很多。根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，多呈球狀或桿狀，形態(tài)規(guī)則，分布均勻；增殖速度快，一般污染后48~72小時(shí)爆發(fā)式增殖；營養(yǎng)消耗快，培養(yǎng)基很快變黃，變渾濁；鏡下觀察有明顯的定向運(yùn)動(dòng)。

處理方法：輕度污染可用10×雙抗清洗處理，重度污染建議消殺后丟棄。

圖1 細(xì)菌污染[1]

二 、 真菌污染

特征：一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，慢慢的會(huì)長出很細(xì)的絲狀物。真菌生長的比較慢，不像細(xì)菌污染那么容易被發(fā)現(xiàn)，會(huì)形成孢子，容易污染其他細(xì)胞。

處理方法：真菌污染較難根除，不建議保留，建議消殺后丟棄。

圖2 真菌污染[2]

三 、 支原體污染

特征：最小的微生物，無法通過光學(xué)顯微鏡看見，但可通過電鏡觀察到。培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁。感染支原體的細(xì)胞，在某一時(shí)間點(diǎn)碎片會(huì)突然增多，隨著傳代，細(xì)胞狀態(tài)顯著變差。支原體污染可通過氣溶膠傳播，影響同一細(xì)胞房其他細(xì)胞。

鑒定方法：PCR法、顯色法、熒光染色法等。

處理方法：若細(xì)胞狀態(tài)尚可，添加支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰；若細(xì)胞狀態(tài)很差，建議消殺后丟棄。

? ? ??（A）? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（B）

圖3 支原體污染[3]

（A）細(xì)胞周圍和細(xì)胞膜上下有大小不等、不規(guī)則熒光著色顆粒

? ? （B）只有細(xì)胞核顯色，細(xì)胞間無熒光著色顆粒

四 、 黑膠蟲污染

特征：400倍顯微鏡下可以看到小黑點(diǎn)在做布朗運(yùn)動(dòng)，小黑點(diǎn)有時(shí)呈點(diǎn)狀，有時(shí)呈小的片狀。透射電鏡下，“黑膠蟲”的形態(tài)為桿狀，長為1300~ 1600 nm，寬為400~500 nm。黑膠蟲污染一般來源于血清，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，會(huì)隨著傳代而傳代，其數(shù)量會(huì)不斷增多，并且會(huì)和細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞因營養(yǎng)不足而死亡。

處理方式：若細(xì)胞狀態(tài)尚可，添加黑膠蟲抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰；若細(xì)胞狀態(tài)很差，建議消殺后丟棄。

圖4 黑膠蟲污染[4]

五 、 細(xì)胞交叉污染

特征：即不同的細(xì)胞混雜在一起

鑒定方法：

同種屬：STR鑒定，多等位基因數(shù)大于3個(gè)。（需考慮本身的遺傳背景，如EA.hy 926為融合細(xì)胞，本身就包含兩套遺傳信息）

不同種屬：PCR法，對(duì)種屬特異性基因進(jìn)行擴(kuò)增，不同種屬產(chǎn)物大小不同。

處理方法：重新引種

圖5 細(xì)胞交叉污染[5]

這次給大家介紹了細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作步驟、培養(yǎng)基成分及類型和細(xì)胞污染分類及處理方法，下次將為大家詳細(xì)介紹“原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)”，關(guān)注漢恒生物，學(xué)習(xí)更多干貨知識(shí)！

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