表2∣人和小鼠黑色素瘤的表征

注入淋巴后形成腫瘤的細(xì)胞比例要高于靜脈注射；與靜脈注射相比，通過淋巴注射會(huì)產(chǎn)生更遠(yuǎn)的轉(zhuǎn)移，即淋巴中的癌細(xì)胞存活率增加，形成轉(zhuǎn)移瘤的機(jī)會(huì)將更高（圖1）。血液中的黑色素瘤受到的氧化應(yīng)激較比淋巴中更強(qiáng)，因此淋巴中黑色素瘤存活率更高。流式細(xì)胞技術(shù)分離出的血液和淋巴中的黑色素瘤細(xì)胞，通過生物發(fā)光圖像可以量化內(nèi)臟器官的轉(zhuǎn)移性疾病負(fù)擔(dān)（圖2）。

圖1 | 與血液相比，淋巴中的黑色素瘤細(xì)胞受到的氧化應(yīng)激作用更少

圖2 | 流式細(xì)胞術(shù)可從血液和淋巴中分離出黑色素瘤細(xì)胞，生物發(fā)光圖像可以量化內(nèi)臟器官的轉(zhuǎn)移性疾病負(fù)擔(dān)

黑色素瘤在血液中發(fā)生鐵死亡

通過皮下注射將人和小鼠黑色素瘤分別移植到NSG和C57BL小鼠中，使其自發(fā)轉(zhuǎn)移。相比皮下或淋巴，大多數(shù)人和小鼠血液中的黑色素瘤細(xì)胞明顯表現(xiàn)出更高的脂質(zhì)ROS水平。鐵可促進(jìn)脂質(zhì)ROS的生成，是鐵誘導(dǎo)細(xì)胞死亡所必須的因素。血漿中的游離鐵濃度比淋巴液中高得多（圖3）。

圖3 | 與淋巴相比，血液中黑色素瘤受鐵死亡影響的細(xì)胞增加

為確定鐵死亡是否會(huì)限制血液中黑色素瘤細(xì)胞的存活，用liproxstatin-1預(yù)處理黑色素瘤細(xì)胞，然后移植到小鼠靜脈中。liproxstatin-1預(yù)處理在有效轉(zhuǎn)移人和小鼠（圖3f/g）的黑色素瘤中顯著增加轉(zhuǎn)移性疾病負(fù)擔(dān)，經(jīng)過同樣預(yù)處理的無效轉(zhuǎn)移黑色素瘤轉(zhuǎn)移性疾病負(fù)擔(dān)沒有明顯增加（圖4）。

圖4?| liproxstatin-1對(duì)皮下腫瘤生長的影響以及其他抑制劑對(duì)轉(zhuǎn)移的影響

測(cè)試鐵死亡的重要性，從兩種小鼠黑色素瘤中敲除了谷胱甘肽過氧化物酶4(Gpx4)的基因。體內(nèi)缺乏Gpx4顯著增加皮下腫瘤中脂質(zhì)ROS的水平；顯著降低血液中黑色素瘤細(xì)胞（圖5）。

圖5 | Gpx4缺失對(duì)小鼠黑色素瘤存活和增殖的影響

油酸可以預(yù)防鐵死亡

采用非靶向代謝組學(xué)的方法，分析從同只小鼠血液、淋巴中分離出的細(xì)胞，表明淋巴與血液中的黑色素瘤細(xì)胞各自聚集在一起（圖6a）。分析富集的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)排名前五的途徑中有三種與脂質(zhì)代謝有關(guān)（圖6b）。磷脂的脂肪酸組成影響癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性，鑒定出的57種脂質(zhì)中，淋巴瘤和血液黑色素瘤細(xì)胞之間油酸差異最大；油酸在淋巴和血液中含量較高，并在淋巴黑色素瘤細(xì)胞中富集（表3、圖7）。

圖6 | 淋巴和淋巴中黑色素瘤細(xì)胞的油酸水平較高，油酸可預(yù)防鐵死亡

表3 | 質(zhì)譜分析的脂質(zhì)種類清單

圖7 | 血漿和淋巴中的脂質(zhì)種類

脂質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，游離油酸的含量很低，無法得出顯著差異，但淋巴中三酰甘油和磷脂中的油酸總量要高于血液，且淋巴的油酸主要存在于三酰甘油中，血漿的油酸主要存在于磷脂中。而實(shí)驗(yàn)證明，油酸以ACSL3依賴的方式阻斷黑色素瘤細(xì)胞的鐵死亡（圖8）。大多數(shù)黑色素瘤經(jīng)過油酸處理后會(huì)形成更多的轉(zhuǎn)移灶。細(xì)胞可通過降低氧化應(yīng)激提高隨后血液遷移過程中的細(xì)胞存活率，來保護(hù)轉(zhuǎn)移細(xì)胞免于鐵死亡，這可能是黑色素瘤免受淋巴中氧化應(yīng)激的主要原因（圖9）。

圖8 | ACSL3對(duì)油酸結(jié)合磷脂及油酸對(duì)鐵死亡的保護(hù)是必需的

圖9 | 黑色素瘤細(xì)胞中潛在鐵死亡調(diào)節(jié)劑的表達(dá)

相關(guān)討論

1. 血液中的細(xì)胞比皮下腫瘤或淋巴中的細(xì)胞表現(xiàn)出明顯更高的脂質(zhì)ROS水平。用erastin和/或Liproxstatin-1進(jìn)行培養(yǎng)，erastin通過抑制胱氨酸攝取來促進(jìn)鐵死亡，Liproxstatin-1通過減少脂質(zhì)過氧化物的積累來抑制鐵死亡。

2. 黑色素瘤細(xì)胞在淋巴中是否比血液中經(jīng)歷了更少的氧化應(yīng)激。將人和小鼠黑色素瘤細(xì)胞移植到NSG或C57BL小鼠皮下，并允許其自發(fā)轉(zhuǎn)移。同一小鼠皮下腫瘤、淋巴和血液中的黑色素瘤細(xì)胞用CellROX DeepRed染色，它檢測(cè)活性氧物種(ROS)，包括羥自由基。對(duì)于免疫受損小鼠的患者來源的異種移植和免疫功能正常小鼠的小鼠黑色素瘤，黑色素瘤細(xì)胞在血液中的ROS水平一直明顯高于皮下腫瘤和淋巴中的ROS水平。細(xì)胞分離后用還原劑2-巰基乙醇處理，很大程度上挽救了活性氧水平的增加。因此，黑色素瘤細(xì)胞擴(kuò)散到血液中與活性氧顯著增加有關(guān)，而擴(kuò)散到淋巴中則沒有。

3. 黑色素瘤細(xì)胞在血液中發(fā)生鐵死亡，而在淋巴中不發(fā)生。兩者間最大差異是油酸。油酸是一種單不飽和脂肪酸，淋巴比血液中含量豐富，它通過減少膜上可供氧化的多不飽和脂肪酸的數(shù)量或密度來抑制培養(yǎng)物中的鐵死亡。

4. 遺傳學(xué)上測(cè)試鐵死亡的重要性，使用CRISPR-Cas9從小鼠黑色素瘤中刪除編碼谷胱甘肽過氧化物酶4(Gpx4)的基因，Gpx4通過減少脂質(zhì)ROS的積累來抑制鐵死亡，鐵死亡限制了血液中黑色素瘤細(xì)胞的生存。Gpx4的缺失并未顯著影響在生理氧水平下培養(yǎng)的小鼠黑色素瘤細(xì)胞的增殖或存活，但確實(shí)降低了在大氣氧水平下培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞的存活或增殖，表明隨著氧化應(yīng)激的增加，GPX4在黑色素瘤細(xì)胞中變得更為重要。

研究討論

淋巴中的黑色素瘤細(xì)胞比血液中經(jīng)歷較少的氧化應(yīng)激，并能形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，提高黑色素瘤細(xì)胞的存活率。淋巴中的黑色素瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡更有抵抗力，并能形成更多轉(zhuǎn)移。與血漿相比，淋巴液中油酸和谷胱甘肽水平升高、淋巴中游離鐵減少，可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激和鐵死亡的降低。油酸以ACSL3依賴性方式保護(hù)黑色素瘤細(xì)胞免于鐵死亡，增加轉(zhuǎn)移性腫瘤的能力。因此暴露于淋巴可保護(hù)黑色素瘤細(xì)胞免于鐵死亡，并提高它們?cè)谘恨D(zhuǎn)移過程中存活的能力。黑色素瘤細(xì)胞在血液中發(fā)生鐵死亡，而在淋巴中不發(fā)生，最大的因素是淋巴比血液中的油酸含量豐富，油酸是一種單不飽和脂肪酸，通過減少膜上可供氧化的多不飽和脂肪酸的數(shù)量或密度來抑制培養(yǎng)物中的鐵死亡。

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enesis. Nature 549, 476–481 (2017).

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ched populations in stem cell and other assays. J. Immunol. Methods 347, 70–78 (2009).

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bolomics data analysis. Curr. Protoc. Bioinformatics 68, e86 (2019).

小鹿推薦

文章通過非靶向代謝組學(xué)及脂質(zhì)組學(xué)等方法，對(duì)淋巴系統(tǒng)保護(hù)黑色素瘤細(xì)胞免于鐵死亡而促進(jìn)轉(zhuǎn)移做了深入研究。研究發(fā)現(xiàn)淋巴系統(tǒng)可為黑色素瘤細(xì)胞提供更高的油酸，經(jīng)歷更少的氧化應(yīng)激，為黑色素瘤細(xì)胞提供更高的存活率和轉(zhuǎn)移能力。通過文章更深層次的研究，未來對(duì)癌細(xì)胞的干預(yù)研究、淋巴系統(tǒng)與癌細(xì)胞的相互關(guān)系及新藥物的研發(fā)機(jī)制提供了更有價(jià)值的研究思路。

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