一、實驗目的

最直觀觀測到蛋白的表達、在細胞中的定位或遷移、存在狀態(tài)。

??表達（有光無光）：1）檢抗原（病毒）；2）檢抗體（單抗的驗證）

??定位：膜定位，胞漿定位，核定位，與某個細胞器共定位（ER/MITO）

??遷移：入核現(xiàn)象（磷酸化的p65/IRF3/STAT1等轉(zhuǎn)錄因子）

??狀態(tài)：彌散，聚集形成點狀顆粒。（應激顆粒SGs、P小體）

二、實驗原理

高度的特異性抗原-抗體免疫學反應。間接免疫熒光是相對直接法而言，耦聯(lián)有熒光色素的二抗（抗抗體）與抗原抗體復合物結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出特異性熒光反應。

熒光素：

1.?異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）是應用最廣泛的熒光素，最大吸收光波長為490--495nm，最大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，主要優(yōu)勢是人眼對黃綠色較為敏感，主要缺點是易淬滅。

2.?菁類染料-Cyanine?dyes：Cy2,?Cy3,?Cy5

3.?Alexa Fluor系列染料:由美國生命技術(shù)公司(Life technologies)旗下的分子探針公司（Molecular Probes）開發(fā)的系列熒光染料

Alexa Fluor 488——最好的綠色熒光基團（FITC）

Alexa Fluor 594——優(yōu)于Texas Red的替代品（Texas Red）

Alexa Fluor 647——優(yōu)于Cy5的替代品（Cy5）

細胞核染料：

1.?DAPI: 4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)，是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料 ，常用于熒光顯微鏡觀測。在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染劑是利用紫外光波長的光線激發(fā)。 DAPI 可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標記的作用，可以產(chǎn)生比DAPI自身強20多倍的熒光。（毒： DAPI強烈致癌，操作時要戴上手套。 -20℃避光保存）

2.?Hochest：既可以用于活細胞也可以用于固定細胞的藍色熒光染料。

共定位：一般是針對兩個蛋白的亞細胞分布（定位）而言，若兩個目的蛋白在胞內(nèi)位置有重疊，那么至少為兩者可能存在相互作用提供了一個必要的空間位置條件，但不是直接證據(jù)。

細胞器定位：利用細胞器紅熒光探針染料（如Mito Tracker Red）將細胞器位置顯現(xiàn)出來，綠色熒光標記目的蛋白。如果目的蛋白與該細胞器存在的位置相同，則紅色熒光與綠色熒光疊加形成黃色熒光位點（foci）。

三、實驗材料

玻片，鑷子，75%酒精，細胞轉(zhuǎn)染用物品，PBS，4%多聚甲醛，甲醇（或Trixon-X-100），搖床，DAPI染色液，甘油，載玻片，激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus FV10）

四、實驗步驟

1. 細胞爬片的處理及接種細胞

實驗室購買的細胞爬片是無菌的（NEST，適合24孔板的大?。?，但是為了進一步避免污染，建議在超凈臺中取出后用75%酒精浸泡5-10分鐘，用鑷子夾取后在酒精燈上將爬片上殘留的酒精燒干，然后輕輕放入細胞板內(nèi)，再接入適量消化好的細胞。

若用HEK-293T細胞等貼壁不緊的細胞進行間接免疫實驗，可先用多聚賴氨酸預處理爬片，再將消化好的細胞接入孔中。

注意:

??接細胞時控制合適的細胞量，避免收樣時細胞量過大影響結(jié)果的觀察；

??接種細胞前，可事先在孔內(nèi)滴一滴生長液，這樣有利于細胞均勻分布（特別是Hela細胞）；

??接種細胞后，建議不要搖板子；

??由于爬片比較薄，每次在酒精燈上燒的時間都不能太長，不然容易破碎；

??盡量保證每個孔中只有一片爬片（因為爬片很薄，比較容易出現(xiàn)一次取到多片的情況），也一定保證每個所需要的孔中都有爬片（仔細檢查，很重要！）。

2. 轉(zhuǎn)染或接毒等

3.?收樣

1）PBS洗3次，每次5 min

2）預冷的固定劑室溫固定15 min（目前實驗室常用：4℃預冷的4%多聚甲醛）

3）PBS洗3次，每次5 min（若用甲醇透化，此步驟可省略）

4）通透劑室溫穿孔10 min（目前實驗室常用：-20℃預冷的100%甲醇）

5）PBS洗3次，每次5 min（該步驟一定不能省略）

6）封閉液37 ℃封閉30~60 min（或4 ℃過夜）

封閉液可以選用5%山羊血清或BSA（牛血清白蛋白）

7）PBS洗3次，每次5 min（若用封閉液稀釋一抗，此步驟可省略）

8）加入一抗（PBS或封閉液稀釋，稀釋倍數(shù)具體看說明書），4 ℃過夜（或37 ℃孵育1 h）

9）PBS洗3次，每次5 min（該步驟一定不能省略）

10）加入熒光二抗（PBS稀釋倍數(shù)具體看說明書），37 ℃孵育1h

11）DAPI染核，室溫15 min

12）PBS洗3次，每次5 min

13）封片、上鏡觀察（甘油：PBS=1:1配制成50%的甘油用于封片）

??根據(jù)實驗需要，可以選用Triton X-100作為通透劑：一般配制成30%的Triton X-100儲備液，4℃避光保存，用PBS稀釋成0.5%的工作濃度；

??若需要孵育兩種或三種一抗，可以同時孵育，也可以逐個孵育；逐個孵育時，兩個一抗之間PBS洗3次，每次5 min。同時孵育的好處：節(jié)約時間；逐個孵育的好處：回收的抗體沒有其它抗體的污染；一抗可以回收使用；

??二抗不需要回收使用，多種二抗可以同時孵育；孵育二抗及其之后的所有操作均需要避光；

??B座的共聚集顯微鏡可以同時檢測三種不同的熒光（所以可以同時檢測三種不同蛋白的定位）；

??DAPI有毒！需配戴手套！

??封片時，每個樣品適當多滴加封片劑（如20μl），會減少氣泡形成的概率;

??封片步驟：

1)??載玻片上做標記后滴一小滴熒光封片液，待用；

2)??將1ml注射器針頭彎曲，從孔內(nèi)鉤起玻片，用鑷子夾出；

3)??將玻片輕放在載玻片上，細胞面與封片液接觸；

?將處理好的玻片置于暗盒中，可以存放一周左右，但最好盡快觀察。