知乎大神分享經(jīng)驗(yàn)

我之前連過(guò)一個(gè)片段，大概有?4000bp?左右，一直連不上。有一次我看到板子沒(méi)長(zhǎng)菌后，就沒(méi)收，繼續(xù)扔到溫箱了。36h后，它長(zhǎng)菌了。陽(yáng)性率還挺高。

后來(lái)我做同源重組，過(guò)夜后不長(zhǎng)菌的板子我就繼續(xù)扔到培養(yǎng)箱再過(guò)夜，每次都連上了（有時(shí)候培養(yǎng)時(shí)間接近48h）。屢試不爽。后來(lái)我還把這個(gè)方法傳授給了我的同門(mén)。至于同源臂，一直用的都是19bp。其實(shí)只要片段and載體的濃度比例正確，一般都是沒(méi)有問(wèn)題的。二者最好不要濃度太低，類(lèi)似個(gè)位數(shù)的ng/uL（no!!?多切或者多p幾管呀）。碰到難連的片段，首先考慮引物設(shè)計(jì)問(wèn)題，載體線(xiàn)性化成功與否，片段與載體比例是否恰當(dāng)（一般3：1），感受態(tài)的問(wèn)題。如果經(jīng)常做分子克隆，畢竟都是用的同一批次，出問(wèn)題的概率應(yīng)該比較小。最后：1.?搖菌時(shí)間可以稍微延長(zhǎng)至2-3個(gè)小時(shí)（像如果實(shí)驗(yàn)室人員比較多，你其實(shí)并不清楚有沒(méi)有人中間把搖床停了）。2.?重新連，跟板子扔在溫箱繼續(xù)培養(yǎng)同步進(jìn)行。試試我的方法。3.?也是最最重要的一點(diǎn)，板子記得處理，保持好習(xí)慣才能有好結(jié)果。All！補(bǔ)充：樓上有一點(diǎn)說(shuō)的沒(méi)錯(cuò)，片段特異性也非常關(guān)鍵。同樣大小的未必是你的條帶。建議測(cè)序以證清白。

測(cè)序假陽(yáng)性，檢查試劑板子是否污染。

如果空載情況：檢查載體，同源臂設(shè)計(jì)情況。

陽(yáng)性篩選檢測(cè)的時(shí)候換引物檢測(cè)。

諾唯贊官方賬號(hào)解答

相信各位經(jīng)常進(jìn)行分子克隆實(shí)驗(yàn)的小伙伴對(duì)載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)非常熟悉，通過(guò)這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，我們能夠?qū)⒆约浩谕腄NA片段組裝到目的質(zhì)粒，隨后經(jīng)過(guò)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等操作得到重組質(zhì)粒。實(shí)現(xiàn)載體構(gòu)建的技術(shù)方法有多種，如酶切連接法、Gateway克隆、同源重組克隆等，其中Vazyme同源重組方法以其簡(jiǎn)單、快速且高效的特點(diǎn)，幫助了眾多小伙伴順利完成了載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。但實(shí)驗(yàn)的道路不總是一帆風(fēng)順，也會(huì)碰到許多問(wèn)題，其中最常見(jiàn)的是涂板不長(zhǎng)克隆。

今天小V帶著大家一起探討這類(lèi)問(wèn)題的分析和優(yōu)化策略，幫助大家在遇到時(shí)，能夠更好更快的找到原因并合理改進(jìn)實(shí)驗(yàn)。

首先，分析引物設(shè)計(jì)、線(xiàn)性化載體及目的片段

01引物設(shè)計(jì)

?建議同源臂長(zhǎng)度15-20bp（酶切位點(diǎn)序列不包含在內(nèi)），GC含量40-60%，超出范圍會(huì)影響重組效率

以下圖為例解析單片端同源重組引物的設(shè)計(jì)原則：

載體pUC19，使用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I、Hind III雙酶切方式線(xiàn)性化

?

灰色框內(nèi)序列組成：同源重組的同源臂+酶切位點(diǎn)

同源重組引物設(shè)計(jì)原則（如下圖所示）

?推薦使用CE Design引物設(shè)計(jì)軟件，選擇對(duì)應(yīng)模塊，按要求輸入序列完成引物設(shè)計(jì)

軟件可從下述幾種途徑獲取：

1.登錄Vazyme公司官網(wǎng)（http://www.vazyme.com），選擇生命科學(xué)→資源支持→常用工具→實(shí)驗(yàn)工具→CE Design引物設(shè)計(jì)軟件

2.復(fù)制鏈接

https://crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html

02線(xiàn)性化載體和插入片段

線(xiàn)性化載體和插入片段的長(zhǎng)度范圍及制備方式

?插入片段和線(xiàn)性化載體，推薦使用切膠回收方式進(jìn)行純化回收（切膠時(shí)間最好控制在3min內(nèi)）。

?使用Nanodrop/Onedrop等儀器檢測(cè)核酸濃度。若濃度小于20ng/μl，建議多做幾管，合并在同一管回收，提高濃度

注：通過(guò)凝膠電泳將片段條帶與DNA Marker條帶的亮度比對(duì)估算條帶濃度，若實(shí)驗(yàn)室的核酸染料為EB染料，可以判斷；若為EB替代物，尤其Gelred等大分子核酸染料，不建議使用該方法。Gelred等大分子染料的濃度線(xiàn)性范圍和EB不同，對(duì)核酸濃度的分辨率不高，不同濃度的核酸條帶亮度差不多。

其次，分析重組反應(yīng)體系和操作

01重組反應(yīng)體系

?線(xiàn)性化載體和插入片段的使用量

線(xiàn)性化載體和插入片段的最適使用量計(jì)算及使用量范圍

?

注：線(xiàn)性化載體和插入片段的區(qū)分依靠長(zhǎng)度判斷，長(zhǎng)度最長(zhǎng)的片段為線(xiàn)性化載體，其余為插入片段；若計(jì)算得到的最適使用量超出對(duì)應(yīng)使用量范圍，則使用對(duì)應(yīng)范圍的極限值。

?重組體系各組分的投入體積最好≥1μl

若投入體積<1μl，可能因小體積取樣不準(zhǔn)確影響投入量的準(zhǔn)確性（回收產(chǎn)物濃度高時(shí)可稀釋使用）。

?重組體系建議按說(shuō)明書(shū)配制

C112、C113體系總體積為20μl，C115體系總體積為10μl。

?進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)，排除其他實(shí)驗(yàn)材料及操作因素的影響

使用試劑盒中提供的線(xiàn)性化載體和插入片段，按說(shuō)明書(shū)配制重組反應(yīng)體系。

02重組反應(yīng)程序與環(huán)境

?反應(yīng)程序

37℃，30min（C112、C113），同源臂GC含量偏高時(shí)可改為50℃，15min；
50℃，5min（C115單片端重組），DNA總量300-400ng時(shí)改為50℃，15min；

50℃，15min（C115多片段重組），4-5個(gè)片段重組時(shí)改為50℃，30min。

注意事項(xiàng)

?反應(yīng)建議使用PCR儀進(jìn)行。水浴鍋等常規(guī)儀器對(duì)溫度控制不精確（尤其37℃），影響重組效率。

最后，分析感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化與涂板操作

01感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化

?感受態(tài)細(xì)胞的選擇：選用克隆用化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，不可選擇電擊感受態(tài)

DH5α、FastT1適合≤15kb質(zhì)粒轉(zhuǎn)化；XL10適合>10kb質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。

?重組產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞用量

重組產(chǎn)物體積：感受態(tài)細(xì)胞體積=1：10，推薦10μl重組產(chǎn)物+100μl感受態(tài)細(xì)胞。

02涂板操作

?抗生素抗性：平板使用抗性與轉(zhuǎn)化的載體抗性需保持一致。

?菌液涂板體積：建議將菌液離心，移液槍吸取丟棄多余LB培養(yǎng)基，保留100μl重懸，全部涂板。

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