研究生復(fù)試中少不了考察科研素質(zhì)及專業(yè)能力，這就對(duì)考生了解學(xué)科熱點(diǎn)、熟悉學(xué)術(shù)前沿提出了較高的要求。想要在考研復(fù)試中脫穎而出，拔得頭籌，那就得具備一定的文獻(xiàn)閱讀能力，從而了解更多專業(yè)詞匯的英文，掌握科研技巧，提高科研素質(zhì)。?

本期“小衛(wèi)帶讀”介紹甲基化與食管鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)內(nèi)容，篇幅較長(zhǎng)。對(duì)于初次接觸該類文章的同學(xué)建議直接從材料與方法入手，可以快速梳理整個(gè)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)。雖然本文難度稍大，但是甲基化是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，同學(xué)們可以提前熟悉，小衛(wèi)為大家摘取并整理了材料與方法的部分，大大降低了閱讀難度。

通過(guò)本次文獻(xiàn)帶讀活動(dòng)，希望大家在面對(duì)完全陌生或者不熟悉的領(lǐng)域的文章時(shí)，能不慌亂，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，即實(shí)驗(yàn)步驟入手，對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行拆分，從而降低閱讀難度。

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文獻(xiàn)內(nèi)容截取

Part 1

患者和標(biāo)本

135名接受手術(shù)的ESC患者。

取初級(jí)ESCC組織和相鄰的正常組織。標(biāo)本被分為兩平行組：一組冷凍并在-80℃提取DNA和RNA；另一組福爾馬林固定并嵌入石蠟中。

Part 2

細(xì)胞系和治療

細(xì)胞系及培養(yǎng)：

??人類食管癌細(xì)胞系（Kyse170、Eca109、TE1 和 TE13）在RPMI-1640 介質(zhì)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中，于37℃和5% CO2條件下輔以10%熱滅活化胎兒牛血清(FBS) (Invitrogen,Carlsbad, CA, USA)培養(yǎng)。

??人類正常的食管上皮細(xì)胞系 HEEpiC 按照制造商的說(shuō)明培養(yǎng)。

治療：

需要時(shí)，細(xì)胞（2 個(gè)× 105/mL） 用 5 μM DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2′-deoxycytidine (5-Aza-dC)(Sigma, St Louis, MO, USA)治療72 小時(shí)，每 24 小時(shí)補(bǔ)充5-Aza-dC；或0.3μM組蛋白去乙酰酶抑制劑TSA (Sigma, St Louis, MO, USA)24小時(shí)；或5 μM 5-Aza-dC 組合 48 小時(shí)，后與 0.3 μM TSA 組合為額外 24 小時(shí)?？刂萍?xì)胞未接受藥物治療。

Part?3

RT-PCR（qRT-PCR）測(cè)定

??總RNA使用TRIzol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取的。

??第一鏈cDNAs按照制造商的說(shuō)明，使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，從總RNA的2μg合成 (Invitrogen, Carlsbad, CA,USA)。

??定量實(shí)時(shí)PCR測(cè)量采用Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technology, Foster City, CA, USA)。

??相對(duì)基因表達(dá)是由 2–ΔΔCT規(guī)范化到? GAPDH所確定的。

??所有樣本都是三次運(yùn)行。

Part 4

雙硫基基因組測(cè)序（BGS）

和轉(zhuǎn)化特異性和甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（BS-MSP）測(cè)定

??基因組DNA通過(guò)簡(jiǎn)化的蛋白酶K消化法提取。

??使用Epiect快速雙硫化轉(zhuǎn)化試劑盒 (Qiagen, Germany)對(duì)基因組DNA進(jìn)行雙硫化修飾。

??BGS測(cè)定后首先確定了CpG島嶼內(nèi)甲基化CpG位點(diǎn)的分配情況。使用一組 BGS引物，然后克隆成pGEM-T載體 (Promega, Madison, WI, USA)，通過(guò)自動(dòng)熒光測(cè)序隨機(jī)挑選和排序的8到10個(gè)克隆。根據(jù)BGS測(cè)定的甲基化CpG位點(diǎn)分布情況，三個(gè)區(qū)域的甲基化狀態(tài)由 BS-MSP 方法使用甲基化或未甲基化特異性底注組確定。

BS-MSP產(chǎn)品在2%的阿加羅斯凝膠上與溴化乙基染色分析。

Part 5

熒光素酶報(bào)告構(gòu)建

和雙熒光素酶報(bào)告分析

??為了探討轉(zhuǎn)錄因子和CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)對(duì)ZNF667-AS1或ZNF667轉(zhuǎn)錄活性的影響，構(gòu)建了ZNF667-AS1和ZNF667的啟動(dòng)器質(zhì)粒。

??放大的碎片嵌入到 pGL3 基本載體(Promega, Madison, WI, USA)，重組質(zhì)粒被測(cè)序和確認(rèn)。

??pGL3-A1、pGL3-Z1 和 pGL3-Z2 結(jié)構(gòu)分別以體外甲基化。

??Eca109 細(xì)胞 （1 × 105/每井）接種24井培養(yǎng)皿24小時(shí)前轉(zhuǎn)染。

??200納米化或甲基化ZNF667-AS1或ZNF667構(gòu)造，pGL3-對(duì)照載體（正對(duì)照），或pGL3基本載體（負(fù)對(duì)照）然后與10ng的pRL-TK載體 (Promega,Madison, WI, USA)使用脂質(zhì)甲胺20000 (Invitrogen,Carlsbad, CA, USA)與10納克的pRL-TK載體共同感染。

??48小時(shí)后，熒光素酶活性由雙熒光素酶報(bào)告機(jī)測(cè)定系統(tǒng)(Promega, Madison, WI, USA)確定。通過(guò)螢火蟲(chóng)熒光素酶與Renilla熒光素酶活性的比值來(lái)表達(dá)熒光素酶活性。

Part 6

染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）測(cè)定

??ChIP 檢測(cè)使用EZ-Magna ChIP A/G(17-10086, Upstate, Millipore, MA, USA)套件進(jìn)行。套件根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行。

??采用抗SP1、E2F1、TET1、H3K27me3、UTX或JMJD3抗體(每CHIP 4μg，Upstate、Millipore、MA、USA)進(jìn)行免疫沉淀。

??用實(shí)時(shí)qPCR分析（補(bǔ)充表2中的引物）對(duì)CHIP衍生DNA進(jìn)行定量分析)。

??試驗(yàn)一式三份。

Part 7

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

??對(duì)于ZNF667-AS1或ZNF667的過(guò)表達(dá)，編碼ZNF667-AS1或ZNF667的cDNA被PCR擴(kuò)增并亞克隆到PCDNA3.1載體中(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，分別命名為pcDNA3.1-ZNF667-AS1或pcDNA3.1-ZNF67。

??Eca109 和TE13 細(xì)胞分別與 pcDNA3.1-ZNF667-AS1 或 pcDNA3.1-ZNF667 表達(dá)質(zhì)?；蚩蛰d體 （pcDNA3.1-NC） 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，最后濃度為 2 μg/μL，使用 FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑 (Promega, Madison, WI, USA)。

??轉(zhuǎn)染后，使用800μg/mL的G418 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)分離抗性細(xì)胞。

??對(duì)于ZNF667-AS1或ZNF667的抑制，Kyse170細(xì)胞分別使用FuGENEHD轉(zhuǎn)染試劑與ZNF667-AS1或ZNF667特異性shRNA質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并用加擾shRNA作為陰性對(duì)照。

??對(duì)于E2F1、TET1、UTX和JMJD3的過(guò)表達(dá)，編碼它們的cDNA被PCR擴(kuò)增并亞克隆到PC DNA3.1載體中(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。

Part 8

細(xì)胞活力測(cè)定

用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)測(cè)定轉(zhuǎn)染Eca109和TE13細(xì)胞或shRNA轉(zhuǎn)染Kyse170細(xì)胞的PCDNA3.1-ZNF667-AS1或PCDNA3.1-ZNF667的活力。

將10微升的CCK-8 (Dojindo, Japan)加入到培養(yǎng)細(xì)胞的100μl中，在37℃含5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中孵育2h后，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量每口井的吸光度值。

Part 9

軟瓊脂菌落形成試驗(yàn)

在克隆形成試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在37℃和5%CO2下定期培養(yǎng)1周。?

存活的菌落在4%多聚甲醛溶液中用結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)可見(jiàn)菌落(≥50個(gè)細(xì)胞)。

Part 10

傷口愈合試驗(yàn)

對(duì)于傷口愈合試驗(yàn)，在培養(yǎng)的細(xì)胞中，用一個(gè)200μL的移液管尖直接劃傷傷口，然后在顯微鏡下創(chuàng)建傷口后，在每口井0、12和24小時(shí)的相同位置捕捉圖像。測(cè)量細(xì)胞遷移到劃痕區(qū)的相對(duì)距離，計(jì)算細(xì)胞愈合百分比。

Part 11

細(xì)胞侵襲試驗(yàn)

細(xì)胞侵襲試驗(yàn)采用24井跨井室(Corning, Kennebunk, ME, USA)，按照制造商的指示進(jìn)行。

?

Part 12

亞細(xì)胞分餾

為測(cè)定ZNF667-AS1的細(xì)胞定位，用核/胞漿分餾試劑盒(BioVision，Milpitas，CA，USA)按照制造商的指導(dǎo)方針收集Kyse170和TE1細(xì)胞（1×106）的胞質(zhì)和核分?jǐn)?shù)。?

以GAPDH基因作為細(xì)胞質(zhì)定位控制，U6基因作為細(xì)胞核定位控制。

Part 13

蛋白印跡分析

在冰冷的RIPA裂解緩沖液中制備總細(xì)胞裂解物，然后超聲處理。用BCA蛋白法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離20μg蛋白質(zhì)裂解物，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上。

首先用ZNF667特異性初級(jí)抗體(1：1000稀釋，兔抗人多克隆抗體，GeneTex, Alton Pkwy Irvine, CA, USA)或E-cadherin(1：1000稀釋，小鼠抗人單克隆抗體，Abcam，英國(guó))孵育，然后用辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合二次抗體孵育。

以GAPDH(1：500稀釋，小鼠抗人單克隆抗體，ABCAM，英國(guó))作為負(fù)載對(duì)照。

Part 14

RNA免疫沉淀（RIP）測(cè)定

用MagnaRIP?RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒(Millipore，Billerica，MA，USA)按照制造商的指示進(jìn)行RIP測(cè)定。

抗TET1、UTX或JMJD3的抗體(Upstate，Millipore，MA，USA)用于免疫沉淀。

以IgG抗體作為陰性對(duì)照。

純化后的RNA進(jìn)行qRT-PCR分析。

Part 15

RNA下拉檢測(cè)

用RiboMAX?大規(guī)模RNA生產(chǎn)系統(tǒng)(Promega，Madison，WI，USA)對(duì)LncRNA ZNF667-AS1進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，用Pierce?磁性RNA蛋白拉下試劑盒(ThermoScience，Rockford，lL，USA)按照制造商的指示進(jìn)行生物素標(biāo)記和純化。

用50pmol純化生物素化轉(zhuǎn)錄本在4℃下孵育2毫克細(xì)胞全細(xì)胞裂解物1小時(shí)；與RNA結(jié)合蛋白復(fù)合物與鏈球菌磁珠分離；這些蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE分離，通過(guò)蛋白印跡分析檢測(cè)。

Part 16

hMeDIP-qPCR分析

采用簡(jiǎn)化的蛋白酶K消化法從細(xì)胞中提取基因組DNA。

如前面所述，進(jìn)行了hMeDIP測(cè)定。

即基因組DNA變性，然后用抗-5hmC抗體或IgG對(duì)照抗體和蛋白G磁性Dynabeads免疫沉淀(Invitrogen，Carlsbad，CA，美國(guó))。然后用蛋白酶K處理珠子，用qPCR分析下拉DNA。引物列于補(bǔ)充表2。

Part 17

統(tǒng)計(jì)分析

??所顯示的所有數(shù)據(jù)都表示從具有均值標(biāo)準(zhǔn)誤差的三重獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。

??實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

??組間差異采用t檢驗(yàn)。

??皮爾遜卡方檢驗(yàn)分析不同組間基因甲基化的情況。

??采用Kaplan-Meier法和Log-rank或Breslow試驗(yàn)來(lái)估計(jì)總體生存率。

??cox多元測(cè)試用于調(diào)整潛在的混淆變量，并評(píng)估患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

??采用SPSS19.0軟件。

??所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)都是雙側(cè)的，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。