稀釋涂布法與平板劃線法是最常用的兩種微生物分離純化方法。

一、平板劃線分離法

由接種環(huán)以菌作沾取少待分離的材料，在無菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來,如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。?

• 用途：一般多用于從菌株的純化

• 優(yōu)點(diǎn)：簡便快速，可以觀察菌落特征

• 缺點(diǎn)：不能用于計(jì)數(shù)

【常見問題】

(1) 培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 ℃左右時(shí)，才能用來倒平板，你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？

答：一般是放到50?℃左右的恒溫水浴鍋里，如果沒有水浴鍋，用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。

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(2) 為什么在用“分劃線分離法”接種時(shí)，每次要灼燒接種環(huán)

答：防止雜菌，提高培養(yǎng)純度。

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(3) 請(qǐng)問生物的平板劃線分離法劃線時(shí)都有那些技巧啊~~~

答：平板劃線分離法要求后面的劃線要在前一次的末尾劃線，在作時(shí)要細(xì)心，劃線的手盡量維持前面的姿勢，左手轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿。

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(4)?用平板劃線分離法分離土壤滲出液中的細(xì)菌后，分離出來的純種菌？

答：只能說放線菌是比較多的，因?yàn)橥寥肋@個(gè)環(huán)境適合它的生長！你說能否分離其他菌？也可以吧！在進(jìn)行劃線之后平板會(huì)出現(xiàn)多菌，像放線菌，細(xì)菌，真菌等；接下來就是鑒定了，再之后就是純化了，這樣應(yīng)該可以分離所需菌種！

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(5) 請(qǐng)問平板劃線分離法的原理是什么?

答：接種針每次劃線都會(huì)造成菌體分布更為稀疏，最終達(dá)到單菌落。

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(6) 用劃線法分離菌種，怎樣保證得到相互分離的菌落

答：這個(gè)需要經(jīng)常作練，不是看看經(jīng)驗(yàn)就能掌握的。要得到單個(gè)菌落，首先需要分劃線，在劃線時(shí)要估計(jì)一下樣本中菌的數(shù)量，以決定2之間重疊的線數(shù)；第一一般很少能出來單個(gè)菌落，因此所占平板面積不要太大，要留給后幾能出單個(gè)菌落的；我總結(jié)的劃線的作要點(diǎn)是：密、直、勻。

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(7) 為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基

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(8) 平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

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(9) 在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：不能?？諝庵械奈⑸锟赡茉诿笊w與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。

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(10) 為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。

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(11) 在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？

答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

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(12) 在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。

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二、稀釋涂布平板法

先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋(如 1:10、1:100 、1:1000、1:10000 …)，然后分別取不同稀釋液少，與已溶化并冷卻至 45 ℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中,，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保培養(yǎng)一定時(shí)間即可出出菌落。如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散。

涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？

答：應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。

• 用途：一般多用于篩選菌株

• 優(yōu)點(diǎn)：可以計(jì)數(shù)，可以觀察菌落特征。
  計(jì)數(shù)時(shí)，首先將待測樣品制成均勻的系列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細(xì)胞分散開，使成單個(gè)細(xì)胞存在（否則一個(gè)菌落就不只是代表一個(gè)細(xì)胞），再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。經(jīng)培養(yǎng)后，由單個(gè)細(xì)胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可計(jì)算出樣品中的含菌數(shù)。此法所計(jì)算的菌數(shù)是培養(yǎng)基上長出來的菌落數(shù)，故又稱活菌計(jì)數(shù)。

• 缺點(diǎn)：操作相對(duì)麻煩

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