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導(dǎo)讀：本文解讀了Robin J Shattock[1]作為通訊作者在Cell & Molecular Biology發(fā)表的文章：《Design-of-experimentsin vitro transcription yield optimization of self-amplifying RNA》。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DoE）方法優(yōu)化了長(zhǎng)saRNA（約9.4kb）的IVT過(guò)程，以產(chǎn)生最大RNA產(chǎn)量，并驗(yàn)證了不同大小RNA的最佳IVT條件。

主要縮略語(yǔ)

DoE：design of experiment，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；

fLuc：firefly luciferase，螢火蟲(chóng)熒光素酶；

GOI：gene of interest，目的基因；

IVT：in vitro transcription，體外轉(zhuǎn)錄；

NTP：nucleoside triphosphate，核苷三磷酸；

pDNA：plasmid DNA，質(zhì)粒DNA；

saRNA：self-amplifying RNA，自擴(kuò)增RNA；

VEEV：Venezuelan Equine Encephalitis Virus，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒。

隨著mRNA疫苗在全世界的廣泛使用，mRNA療法展現(xiàn)了強(qiáng)大的能力。近期，一項(xiàng)名為自擴(kuò)增RNA疫苗（saRNA）新一代mRNA疫苗開(kāi)始受到關(guān)注。saRNA是一種單鏈RNA，來(lái)源于正鏈病毒基因組，如α病毒。與傳統(tǒng)mRNA疫苗相比，新型的saRNA疫苗，可以在體內(nèi)進(jìn)行自我擴(kuò)增，因此只需要極低的劑量，就能通過(guò)自我擴(kuò)增，產(chǎn)生高水平抗原，引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。目前的IVT方案主要針對(duì)小RNA（<100 nt）進(jìn)行開(kāi)發(fā)和優(yōu)化，但不適用于saRNA。因?yàn)閟aRNA更長(zhǎng)且具有高度的二級(jí)結(jié)構(gòu)，所以IVT的最佳條件可能與mRNA不同。因此，本研究的目標(biāo)是使用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DoE）方法來(lái)優(yōu)化IVT，提高長(zhǎng)saRNA（約9.4kb）的產(chǎn)率。

一、DoE流程

DoE是一種用于確定已知影響特定過(guò)程或過(guò)程輸出的每個(gè)因素或變量之間關(guān)系的方法。通過(guò)使用這種方法，我們?cè)噲D建立每個(gè)變量之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，并確定最有影響的因素，以使最大化輸出。

1、首先進(jìn)行一個(gè)完整的兩級(jí)析因DoE，以確定哪些成分在IVT中具有最高的影響以及它們的次要相互作用；

2、利用全三級(jí)析因DoE來(lái)探索鈉（Na+）、鎂（Mg2+）和NTPs之間的關(guān)系，并確定乙酸根離子和氯離子之間的差異，以提高RNA濃度；

3、滴定乙酸鎂（MgOAc2）的濃度，以確定NTPs和Mg2+之間的最佳比例；

4、滴定T7 RNA聚合酶的濃度；

5、在IVT期間的不同時(shí)間點(diǎn)增加了乙酸鈉（NaOAc）濃度，以觀察是否能提高RNA產(chǎn)量；

6、最終篩選DoE，以了解加入焦磷酸酶、亞精胺、二甲基亞砜（DMSO）、甜菜堿和Triton X-100或吐溫20的重要性。

7、比較了在兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)添加和不添加焦磷酸酶的最佳條件；

8、用最佳IVT條件制備不同大小的RNA，并在體外轉(zhuǎn)染這些RNA，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以確認(rèn)蛋白質(zhì)表達(dá)。

耀海生物提供mRNA體外轉(zhuǎn)錄服務(wù)，具有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化，可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)達(dá)10kb mRNA片段的制備，轉(zhuǎn)錄比可達(dá)1:100~1:200。

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二、DoE實(shí)驗(yàn)結(jié)果

IVT的影響因素見(jiàn)表1。使用1μg線(xiàn)性化DNA模板，并在所有IVT反應(yīng)中保持恒定，每個(gè)反應(yīng)的最終體積為100μL，在37°C下孵育2、4或6小時(shí)。

DoE實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鎂對(duì)RNA產(chǎn)量的影響最大，乙酸根離子比氯根離子更有效地提高RNA的產(chǎn)量。此外，鎂和核苷三磷酸鹽（NTPs）之間的相互作用對(duì)IVT非常重要。在IVT期間進(jìn)一步添加乙酸鈉（NaOAc）對(duì)RNA產(chǎn)量的增加無(wú)益。此外，焦磷酸酶對(duì)IVT生產(chǎn)不是必需的。最佳的IVT方法可用于合成不同長(zhǎng)度的RNA。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了通過(guò)IVT合成高質(zhì)量和數(shù)量的saRNA的能力，并且每種組分的最佳量對(duì)于它們的相互作用以產(chǎn)生高RNA產(chǎn)量至關(guān)重要。

三、IVT最佳條件

最終優(yōu)化的IVT條件見(jiàn)表2。

四、IVT最佳條件驗(yàn)證——可用于合成編碼不同目的基因的saRNA，在體外具有良好的蛋白質(zhì)表達(dá)

為了確認(rèn)IVT最佳條件可用于合成不同大小的RNA，本研究制備了另外四種pDNA模板，用于制備編碼不同GOI的saRNA，包括增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP，8.5kb）、多藥耐藥基因-1（MDR1，11.5kb）和副流感病毒5的多藥耐藥基因-1（MDR1-PIV5，12.4kb）。此外，本研究還使用編碼fLuc的pDNA來(lái)合成mRNA fLuc（1.8kb）。每個(gè)RNA種類(lèi)的大小在1.8至12.4 kb之間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論RNA大小如何，優(yōu)化的IVT條件（表2）產(chǎn)生了高產(chǎn)量的優(yōu)質(zhì)RNA（圖2A和B）。VEEV-fLuc、VEEV-eGFP、VEEV-MDR1、VEEV-MDR1-PIV5和mRNA fLuc的總產(chǎn)量分別為118、150、142、169和41μg；而VEEV-fLuc、VEEV-eGFP、VEEV-MDR1、VEEV-MDR1-PIV5和mRNA fLuc的平均摩爾數(shù)分別為38.94、54.77、38.32、42.48和70.28 pmol。最后，研究者將這些RNA轉(zhuǎn)染HEK293T.17細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收獲細(xì)胞，以確認(rèn)每個(gè)GOI中saRNA和fLuc mRNA的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)觀察到每個(gè)saRNA和fLuc mRNA都適當(dāng)表達(dá)蛋白質(zhì)（圖2C）。

總結(jié)

本研究的目的是利用DoE方法來(lái)優(yōu)化長(zhǎng)saRNA的IVT過(guò)程，以實(shí)現(xiàn)最大的RNA產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)鎂在IVT中起著最重要的作用，尤其是它與NTPs的相互作用，這兩種成分的正確平衡是產(chǎn)生高RNA濃度所必需的。此外，與氯離子相比，乙酸根離子對(duì)IVT更有效，IVT在MgOAc275mM和NTPs每10mM時(shí)最有效。通過(guò)在IVT過(guò)程的不同時(shí)間點(diǎn)添加NaOAc來(lái)維持離子強(qiáng)度并不能產(chǎn)生高RNA產(chǎn)量。研究還發(fā)現(xiàn)，降低T7 RNA聚合酶阻礙了IVT過(guò)程，并且IVT不需要焦磷酸酶來(lái)產(chǎn)生最大的RNA濃度。最后，我們觀察到IVT的優(yōu)化條件可用于產(chǎn)生1.8-12.4kb的RNA，并且每種類(lèi)型的RNA都是功能性的，因此一旦轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中就能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。

由于許多IVT方案已針對(duì)較短的mRNA進(jìn)行了優(yōu)化，因此DoE方法的應(yīng)用被證明對(duì)了解每種反應(yīng)組分之間的相互作用以產(chǎn)生最大產(chǎn)率的長(zhǎng)RNA具有指導(dǎo)意義。通過(guò)確定IVT期間saRNA共加帽的最佳條件，可以進(jìn)一步獲得益處。然而，本研究?jī)?yōu)化的IVT反應(yīng)條件可產(chǎn)生高產(chǎn)量的saRNA，可用于生產(chǎn)大量用于研發(fā)目的的saRNA，并有可能擴(kuò)大到saRNA疫苗和生物治療藥物的GMP生產(chǎn)中。

參考文獻(xiàn)

[1] Samnuan K, Blakney AK, McKay PF and Shattock RJ. Design-of-experimentsin vitro?transcription yield optimization of self-amplifying RNA [version 1; peer review: 1 approved with reservations].?F1000Research?2022,?11:333