來源??TMR Publishing Group

?作者??Traditional Medicine Research 編輯部??

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研究亮點

從延胡索散中鑒定出34種體外成分和20種血液原型成分。有效成分可能通過作用于AKT1和TNF靶點來調(diào)節(jié)PI3K-AKT和絲裂原活化蛋白激酶的信號通路，從而在關節(jié)炎的治療中發(fā)揮作用。

研究背景

延胡索散由延胡索、補骨脂、牛膝和當歸組成，是一種歷史悠久的中草藥配方，主要用于治療關節(jié)炎。雖然延胡索散的臨床療效早已得到認可，但其作用機制和生物活性成分目前仍不清楚。因此，迫切需要一種準確、靈敏、可靠的方法來鑒定延胡索散的體內(nèi)藥物化學成分，以探索其作用機制。

研究方法

延胡索散湯劑由原方的四味藥材按1：1：1：1的比例制成。反復浸泡煮沸提取，過濾，濃縮，得到相當于0.15 g/mL原料藥的提取物，用UPLC-Q-TOF/MS進行延胡索散湯劑中的成分分析。

以1.5 g/kg（臨床等效劑量）的劑量對大鼠灌胃延胡索散提取物。在給藥后0.5、1、2、4、8、12和24小時對應的時間點收集含藥血液樣本，空白組相同。將每只大鼠所有時間的含藥血漿樣品混合，總共制備了六個大鼠血漿樣品。血漿經(jīng)過處理后，UPLC-MS/MS進行延胡索散體內(nèi)成分分析。

將經(jīng)過UPLC-Q-TOF/MS和UPLC-MS/MS聯(lián)合測出的吸收成分進行網(wǎng)絡藥理學以預測靶點和途徑。AutoDock軟件隨后被用于分子對接研究，以篩選潛在的藥效物質。

研究結果

UPLC-Q-TOF/MS初步鑒定延胡索散的成分譜

應用UPLC-Q-TOF/MS技術，對正電離質譜模式的延胡索散進行了初步組分分析。采用UNIFI軟件進行快速化學成分鑒定。共鑒定出34種成分，其中生物堿14種，黃酮類7種，香豆素類4種，其他成分9種。

UPLC-MS/MS對延胡索散藥典成分的進一步確認

在本研究中，應用UPLC-MS/MS方法進一步探索和驗證延胡索散的成分，以便于檢測低含量的吸收成分。為了保證該方法的準確性，選擇了符合延胡索散藥典標準的成分，建立了UPLC-MS/MS篩選方法。通過比較標準品在兩種儀器上的保留時間，證實了該方法的適用性。經(jīng)UPLC-Q-TOF/MS和UPLC-MS/MS分析，阿魏酸、可樂定、補骨脂素等標準品的保留時間相似，差異小于0.2 s。后通過UPLC-MS/MS進一步確認了總共30種成分（包括5種化合物異構體）。

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基于UPLC-MS/MS鑒定大鼠血漿中延胡索散的吸收成分

本研究分析了大鼠血漿中延胡索散的可吸收生物活性成分。用上面建立的UPLC-MS/MS方法篩選成分。吸收的成分如表1所示。如圖3所示，在給藥血漿中總共發(fā)現(xiàn)了20種原型成分。

延胡索散吸收成分的靶點預測

將上述測得的化合物導入到SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預測這些化合物對應的作用靶點，共得到630個作用靶點。

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潛在的治療靶點和途徑

檢索Online Mendelian Inheritance in Man和gene cards數(shù)據(jù)庫，共獲得979個疾病靶標。通過組分靶標和疾病靶標的相互作用，獲得了131個與延胡索散治療關節(jié)炎效果相關的直接靶點。通過String database數(shù)據(jù)庫分析，得出AKT1、TNF、CXCL8、STAT3和MAPK8等靶點在網(wǎng)絡中起重要作用。Gene Ontology數(shù)據(jù)庫分析表明，相關的生物過程主要涉及炎癥反應和血管保護。此外，通過KEGG分析獲得了29條KEGG通路 （P < 0.05），其結果可分為五個方面：PI3K-AKT、MAPK、凋亡、Ras、VEGF和ErbB是與細胞增殖、凋亡和分化相關的6條通路；趨化因子、TNF和NF-κB是與炎癥相關的3條通路；b細胞受體、T細胞受體和Toll樣受體是3條免疫通路，F(xiàn)OXO和AMPK是2條氧化應激通路。KEGG結果表明，延胡索散可能通過多途徑、多靶點有效治療關節(jié)炎。

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復合靶向通路網(wǎng)絡構建

為了更直觀地表示化合物、靶標和途徑之間的關系，構建了一個化合物-靶標-途徑網(wǎng)絡（圖5）。網(wǎng)絡圖中組分、靶點和通路之間的復雜聯(lián)系直觀地展示了延胡索散治療關節(jié)炎的復雜機制。

分子對接

通過分子模擬對接，檢測了延胡索散主要活性成分與核心靶標的結合能力，進而篩選出活性成分。根據(jù)網(wǎng)絡藥理學的預測結果和骨關節(jié)炎相關的病理變化，我們選擇了延胡索散、抗軟骨細胞凋亡的靶點以及PI3K-AKT信號通路進行分子對接驗證。通過檢索相關文獻，我們確定受體蛋白分子為caspase-3、Bax、Bcl-2、AKT、PI3K和mTOR。選擇硫酸氨基葡萄糖作為療效方面的陽性藥物，青蒿琥酯和紫草素為該途徑的陽性藥物。這三種陽性藥物的組合用作參考，評估20種血液原型成分的組合。結果顯示，這20種組分的平均結合能均小于三種陽性對照化合物，表明20種輸注血液的組分和六種配體蛋白均具有潛在的結合能力，并且可以在空間上相互匹配以實現(xiàn)牢固和穩(wěn)定的結合。

結論

本文提出了一種基于UPLC-Q-TOF/MS和UPLC-MS/MS相結合的大鼠口服延胡索散后成分鑒定方法。在大鼠血漿中鑒定出總共20種化合物。吸收的主要化合物有延胡索乙素、當歸素和補骨脂素。此外，通過網(wǎng)絡藥理學和基于所吸收化合物的分子對接，進一步研究了延胡索散的藥理機制。

結果表明，使用延胡索散治療關節(jié)炎可能通過抗炎作用、對軟骨細胞的抗凋亡作用、抑制細胞外基質降解、免疫調(diào)節(jié)和氧化應激途徑調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。

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引用格式

Qu YX, Zhang N, Luo J, et al. Systematically characterized mechanism of Yanhusuo powder ingredient absorbed in rat plasma for treatment osteoarthritis via UPLC-Q-TOF/MS with UPLC-MS/MS and network pharmacology.?Tradit Med Res. 2021;6(6):51. doi:10.53388/TMR20210603232

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