當(dāng)2012年Brent R. Stockwell首次提出了鐵死亡的概念之后，便開始鐵死亡研究熱。這期就帶你了解什么是鐵死亡，一起探索鐵死亡的奧秘所在！

一、什么是鐵死亡

鐵死亡是一種依賴于鐵離子的程序性細(xì)胞死亡形式，是由于多種因素（如藥物或基因因素）造成代謝過程的改變和過氧化脂質(zhì)的積累，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損而引起。

鐵死亡有一些不同于其他程序性死亡的特殊細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，例如線粒體變小，線粒體膜密度增高，線粒體嵴減少或消失，線粒體外膜破裂。

鐵死亡與神經(jīng)退行性疾病、癌變、中風(fēng)、腦出血、創(chuàng)傷性腦損傷、心臟缺血再灌注損傷和哺乳動(dòng)物腎臟變性有關(guān)，也與植物的熱應(yīng)激有關(guān)。

二、鐵死亡的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

鐵死亡的調(diào)控主要是鐵死亡防御系統(tǒng)和鐵死亡執(zhí)行系統(tǒng)的博弈（圖1）。鐵死亡執(zhí)行系統(tǒng)包括PUFA-PL的合成和過氧化，以及鐵代謝。由LPCAT3和ACSL4介導(dǎo)的PUFA-PL合成，以及ALOXs和POR介導(dǎo)的PUFA-PL過氧化是鐵死亡發(fā)生的必要條件。

鐵死亡防御系統(tǒng)主要包括GPX4依賴的系統(tǒng)（SLC7A11-GSH-GPX4軸）和GPX4非依賴的系統(tǒng)（如NAD(P)H-FSP1-CoQ10軸和DHFR-BH4-GCH1軸）。

三、鐵死亡執(zhí)行系統(tǒng)

1）PUFA-PL合成與過氧化

ACSL4和LPCAT3促進(jìn)多不飽和脂肪酸 (PUFA) 摻入磷脂中形成多不飽和脂肪酸的磷脂 (PUFA-PL)。PUFA-PLs 易受脂氧合酶 (ALOXs) 介導(dǎo)的自由基引發(fā)的氧化作用。

這種氧化作用最終會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)雙層的破壞并影響膜功能，從而促進(jìn)鐵死亡。乙酰輔酶A羧化酶?(ACC)?催化的乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，這是合成一些 PUFA以及執(zhí)行鐵死亡所必需的。

ACSL4、LPCAT3或ACC的失活或減弱均可阻斷鐵死亡。因?yàn)镻UFA中存在雙烯丙基部分，PUFA-PL容易發(fā)生過氧化作用，這主要由于芬頓反應(yīng)驅(qū)動(dòng)的非酶促自氧化催化，其中鐵充當(dāng)催化劑。

此外，POR或ALOXs介導(dǎo)的酶促反應(yīng)也可促進(jìn)脂質(zhì)過氧化。單不飽和脂肪酸?(MUFA)?由于缺乏雙烯丙基部分而不易過氧化，其通過取代細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸來抑制脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。參與MUFA-PL合成的酶失活，例如SCD1和ACSL3，使癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感。

2）鐵代謝

鐵不僅通過芬頓反應(yīng)（Fenton reaction）來直接過氧化 PUFA-PL，還是脂質(zhì)過氧化酶（如 ALOX 和 POR）的必需輔助因子。

細(xì)胞的鐵存儲(chǔ)在鐵蛋白ferrintin中，其蛋白量特別是重鏈的表達(dá)減少會(huì)增加鐵池和以及細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感程度，NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白自噬降解（ferritinophagy）將儲(chǔ)存在鐵蛋白中的鐵釋放到不穩(wěn)定的鐵池中，從而促進(jìn)鐵死亡；此外，抑制GOT1也可通過增強(qiáng)ferritinophagy以增加不穩(wěn)定的鐵池，并促進(jìn)癌細(xì)胞鐵死亡。

3）線粒體代謝

線粒體在能量和ROS生成，以及PUFA-PL合成中的作用驅(qū)動(dòng)線粒體脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。首先，線粒體產(chǎn)生的ROS對(duì)于脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的發(fā)生至關(guān)重要。

此外，線粒體中的電子傳遞和質(zhì)子泵對(duì) ATP 的產(chǎn)生很重要，在能量（即 ATP）充足的情況下，AMPK 不能被有效激活，從而無法滅活A(yù)CC，這促進(jìn) PUFA-PL 合成和后續(xù)的鐵死亡發(fā)生。最后，線粒體在細(xì)胞代謝的生物合成途徑中的作用也有助于鐵死亡，其中三羧酸?(TCA)?循環(huán)和多種回補(bǔ)反應(yīng)（anaplerotic reactions，例如谷氨酰胺分解）可通過促進(jìn) ROS、ATP 和/或 PUFA-PL 的生成來驅(qū)動(dòng)鐵死亡。

四、鐵死亡防御系統(tǒng)

鐵死亡防御機(jī)制涉及細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)來直接中和脂質(zhì)過氧化物，主要包括經(jīng)典的GPX4調(diào)控鐵死亡機(jī)制：GCyst(e)ine/GSH/GPX4系統(tǒng)，GPX4非依賴性鐵死亡調(diào)控機(jī)制：NADPH/FSP1/CoQ10系統(tǒng)，GCH1/BH4/DHFR系統(tǒng)。

1）Cyst(e)ine/GSH/GPX4系統(tǒng)

多年來，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)鐵死亡的唯一機(jī)制，而且基因敲除和抑制GPX4活性仍然是引發(fā)鐵死亡最經(jīng)典的方法。GPX4具有三種亞細(xì)胞定位，即細(xì)胞溶質(zhì)、線粒體和核GPX4，其中細(xì)胞溶質(zhì)GPX4在防御鐵死亡中發(fā)揮重要作用。

還原型谷胱甘肽?(GSH)?是GPX4的輔因子，由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸合成，其中半胱氨酸是限速前體。

大多數(shù)癌細(xì)胞主要通過SLC7A11介導(dǎo)的胱氨酸（半胱氨酸的氧化二聚體形式）攝取以獲取足夠的半胱氨酸，因此，Cyst(e)ine/GSH/GPX4軸被認(rèn)為構(gòu)成了防御鐵死亡的主要細(xì)胞系統(tǒng)。然而，在GPX4失活后，一些癌細(xì)胞系仍能抵抗鐵死亡，這表明存在額外的鐵死亡防御機(jī)制。

2）NADPH/FSP1/CoQ10系統(tǒng)

FSP1（鐵死亡抑制蛋白1）被認(rèn)為在某些特定條件下具有促凋亡作用，FSP1可經(jīng)細(xì)胞質(zhì)或線粒體轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，從而觸發(fā)DNA降解。

然而近些年的研究顯示，F(xiàn)SP1具有平行于Cyst(e)ine-GSH-GPX4軸的抗鐵死亡機(jī)制。FSP1屬于II型NADH：醌氧化還原酶NDH-2家族，是傳統(tǒng)線粒體呼吸系統(tǒng)的一個(gè)分支，催化與復(fù)合體I同樣的反應(yīng)，只是不泵送質(zhì)子。

FSP1被發(fā)現(xiàn)主要定位于脂滴和質(zhì)膜，是一種清除有害脂質(zhì)過氧化物的系統(tǒng)。從機(jī)制上講，線粒體外泛醌被FSP1從CoQ10還原而來，既可直接捕獲脂質(zhì)自由基，也可以通過回收α-生育酚來間接充當(dāng)抗氧化的角色。

3）GCH1/BH4/DHFR系統(tǒng)

一種不依賴于GPX4的鐵死亡抑制基因，即鳥苷三磷酸環(huán)水解酶GCH1，它是合成四氫生物蝶呤BH4的限速酶。BH4是一種頗具實(shí)力的自由基捕獲抗氧化劑，但它的回收再利用需要二氫葉酸還原酶DHFR的參與，因此如果阻斷二氫葉酸還原酶DHFR，則可協(xié)同GPX4抑制劑發(fā)揮誘導(dǎo)鐵死亡的作用。

以外，BH4還可以通過將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸來促進(jìn)CoQ10的合成，這是它發(fā)揮抗氧化作用的另一種方式。

五、鐵死亡相關(guān)特征

鐵死亡在細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、生化特征以及基因水平特征上都與凋亡、自噬、壞死等傳統(tǒng)的細(xì)胞死亡方式具有顯著的變化，具體表現(xiàn)為：

1）細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

超微形態(tài)學(xué)特征顯示細(xì)胞膜斷裂，線粒體變小、膜密度增高、線粒體脊減少或消失、線粒體外膜斷裂，細(xì)胞核大小正常、但缺乏染色質(zhì)凝聚。電鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)線粒體變小及雙層膜密度增高。

2）生化特征變化

鐵和活性氧(ROS)聚集，激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)系統(tǒng)，降低胱氨酸的攝取、耗竭胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH），抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白system Xc-?和增加NADPH氧化酶（NOXs），釋放花生四烯酸（ARA）等介質(zhì)。

3）基因水平特征變化

鐵死亡受細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的嚴(yán)密調(diào)節(jié)，包括鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)通路，RAS/Raf/MAPK通路以及胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)通路。

細(xì)胞內(nèi)Cox2, ACSL4, NOX1, GPX4, SLC7A11, Ferritin和Ferritin Light Chain等相關(guān)因子發(fā)生變化，其中Cox2, ACSL4和NOX1在鐵死亡細(xì)胞中表達(dá)上調(diào); GPX4, SLC7A11, Ferritin和Ferritin Light Chain在鐵死亡細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。

4）免疫學(xué)特征

損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)釋放前炎癥介質(zhì)(如HMGB1等)。

六、鐵死亡常見檢測(cè)方法

1）形態(tài)學(xué)觀察
細(xì)胞形態(tài)觀察:

利用透射電鏡直接對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時(shí)線粒體變小以及線粒體膜密度較大;
線粒體形態(tài)觀察:

向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染LifeAct-GFP熒光蛋白，一定時(shí)間后通過有絲分裂追蹤器觀察線粒體的形態(tài)。

2）新陳代謝檢測(cè)

1.細(xì)胞活性檢測(cè) CCK-8

2.細(xì)胞內(nèi)鐵水平檢測(cè)

可以使用PGSK探針檢測(cè)，通過流式細(xì)胞術(shù)或共聚焦顯微鏡監(jiān)測(cè)活細(xì)胞內(nèi)鐵含量的細(xì)胞膜透性染料，在鐵死亡的細(xì)胞中，PGSK的綠色熒光會(huì)減弱。

3.活性氧水平檢測(cè)

通過C11-BODIPY探針檢測(cè)，在鐵死亡細(xì)胞中，探針會(huì)由紅色轉(zhuǎn)化為綠色。

4.線粒體膜電位檢測(cè)

可以使用TMRE熒光染料檢測(cè)，TMRE能夠特異性標(biāo)記有活性的線粒體，是一種細(xì)胞膜可穿透性的，正電荷的，橘紅色熒光染料。當(dāng)線粒體膜電位降低時(shí)，熒光減弱。

5.qPCR/Western Blot檢測(cè)

檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)與鐵死亡相關(guān)的因子變化，例如Cox2, ACSL4和NOX1在鐵死亡細(xì)胞中表達(dá)上調(diào); GPX4, SLC7A11, Ferritin和Ferritin Light Chain在鐵死亡細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。

七、鐵死亡關(guān)鍵調(diào)控分子 SLC7A11

System xc-?是一種不依賴鈉的反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由兩個(gè)通過二硫鍵連接的亞基組成，包括重鏈亞基溶質(zhì)載體族3成員2 (SLC3A2)和輕鏈亞基溶質(zhì)載體族7成員11 (SLC7A11)。

SLC7A11是一種多通道跨膜蛋白，在xc -系統(tǒng)中介導(dǎo)胱氨酸/谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，而SLC3A2是一種單跨膜蛋白，是維持SLC7A11蛋白穩(wěn)定性和適當(dāng)?shù)哪ざㄎ坏陌閭H。

System xc-?以1:1的比例用胞內(nèi)谷氨酸來?yè)Q取胞外的胱氨酸(Cys2)，胱氨酸在谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)和谷胱甘肽合成酶(GSS)的催化作用下合成谷胱甘肽(GSH)。

SLC7A11在多種應(yīng)激條件下被誘導(dǎo)表達(dá)，包括氧化應(yīng)激，氨基酸饑餓，代謝應(yīng)激和遺傳毒性應(yīng)激，可能是一種適應(yīng)性反應(yīng)，使細(xì)胞能夠在應(yīng)激條件下恢復(fù)氧化還原穩(wěn)態(tài)并維持存活。

激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）和/或核因子紅系相關(guān)因子2（NRF2）是調(diào)控壓力誘導(dǎo)的SLC7A11表達(dá)的兩個(gè)主要轉(zhuǎn)錄因子。此外，p53可抑制SLC7A11的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)鐵死亡，在腫瘤抑制中起關(guān)鍵作用。而ATF3也可以與SLC7A11啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其表達(dá)。

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