1，ORF簡介

開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）從起始密碼子開始，到終止密碼子結束的連續(xù)堿基序列，具有蛋白質編碼潛能。由于密碼子（codon）讀寫起始位點的不同，mRNA序列可能按照6種ORF閱讀和翻譯。如圖1所示，對于序列1，可以從A開始讀，也可以從T開始讀，也可以從G開始讀，因此一條序列上就有3種讀碼方式。同樣的，互補鏈上也有3種，共6種ORF閱讀方式。理論上，6種讀碼框都有“開放”的可能，但是現實世界中，生物體一般會使用不多于2個“開放讀碼框”。

圖1. 6種讀碼框示意圖

2，NCBI ORFfinder

ORF識別是確定哪種開放閱讀框對應真正的多肽編碼序列的過程。NCBI ORFfinder為最常用的ORF預測在線工具，使用也非常簡單。

2.1，打開NCBI ORFfinder網站

在瀏覽器中輸入網站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/

圖2. NCBI ORFfinder

2.2，粘貼序列并選擇參數

Fasta格式文件是存儲核酸或者蛋白質序列的一種標準格式。是以大于號“>”開頭，后邊接序列名字為第一行，其余行為序列的一種標準序列存儲文件格式。如圖所示：

圖3. Fasta格式序列

這個文件中包含兩條序列，一條是seq1，一條是seq2。

進行ORFfinder預測時，我們要將fasta格式的序列拷貝粘貼到輸入框中（一次一條）。

這里我們粘貼來自lncipedia（https://lncipedia.org/，lncRNA百科全書網站）的一條lncRNA序列PITPNM2-AS1:6進行預測。然后選擇參數（一般默認）。最后點擊提交按鈕，等候幾秒鐘后會出現結果。

圖4. NCBI ORFfinder序列提交及參數選擇

2.3，結果查看

結果包括：

1，預測的ORFs

2，6種讀碼框（需要點擊Six-frame translation處按鈕才顯示）

3，每個預測的ORF所處的讀碼框、坐標及長度（核苷酸|氨基酸），可以下載查看具體核酸序列及氨基酸序列等

4，對應的氨基酸序列，可以進行blast等操作

圖5. NCBI ORFfinder結果

然而，相較于舊版ORFfinder（圖5），新版NCBI ORFfinder的結果不好在論文中展示?？鄬o果后，我們參考文獻中舊版ORFfinder的樣式，開發(fā)了在線ORFfinder結果可視化功能。

圖6. 舊版NCBI ORFfinder結果

3，ORFfinder在線可視化（仿舊版）

3.1，打開繪圖頁面

微生信-在線NCBI ORFfinder結果可視化 (bioinformatics.com.cn)

圖7. ORFfinder可視化頁面

3.2，拷貝示例數據

下載示例數據，該模塊的輸入為第一個sheet的內容。

（可以將第2個sheet的序列提交到NCBI ORFfinder，默認參數，獲得sheet1的內容）。

圖8. 輸入數據示例

第一列為ORF的名字（label），第二列為鏈（Strand），第三列為讀碼框編號（Frame），第4、5列為ORF的起始和終止坐標，第6列為長度，包括核酸和蛋白的長度。

3.3，粘貼示例數據

必需輸入包括兩個：1，orffinder的結果，2，序列總長度（可由NCBI ORFfinder結果中查到）

圖9. 必需輸入

3.4，修改參數，并提交

圖10. 顏色等參數

開放了圖片尺寸，ORF顏色，最長ORF顏色等參數，以滿足不同的繪圖需求。

3.5，提交出圖

結交約3秒后，在頁面右側出現結果預覽圖，其中最長ORF用紫紅色標注。我們提供了4種圖片格式供下載使用，兩種矢量圖（pdf，svg）和兩種標量圖（600 dpi tiff和300 dpi png）。

圖11. 仿ORFfinder舊版可視化結果

注意：舊版中坐標小的在左側，大的在右側，跟新版略有不同。這里使用的左側小，右側大的排序方式。

沒有預覽就是沒有出圖，這時請參考示例數據，檢查輸入數據格式！

遇到文字截斷，需要修改字體、調整字體大小等，使用scape 軟件。