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肺特異性間充質(zhì)在肺發(fā)育和疾病中起著至關(guān)重要的作用，但通過(guò)定向分化產(chǎn)生肺特異性間充質(zhì)的研究明顯滯后。

今天小學(xué)社給大家?guī)?lái)一篇高分定向分化肺特異性間充質(zhì)的研究。本文細(xì)胞的模型建立到類(lèi)器官驗(yàn)證分析，條理清晰步驟詳細(xì)，一氣呵成。這份研究成果一定會(huì)給您帶來(lái)全新的學(xué)習(xí)收獲，為相關(guān)研究提供思路。對(duì)肺特異性間充質(zhì)定向分化感興趣的小伙伴快快學(xué)起來(lái)！

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肺間質(zhì)在肺部發(fā)育和疾病中發(fā)揮著重要作用。盡管一些小鼠模型研究已經(jīng)幫助確定了可能參與肺間充質(zhì)規(guī)范和分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，但目前人們對(duì)小鼠早期肺間質(zhì)的規(guī)范和分化的了解仍然有限，并且肺間質(zhì)在人類(lèi)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

為了彌補(bǔ)這一知識(shí)空白，本文的研究人員生成了一種攜帶肺特異性間質(zhì)報(bào)告基因/系譜示蹤劑的小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)系。通過(guò)這個(gè)模型，研究人員確定了調(diào)節(jié)指定肺間質(zhì)所必需的途徑（維甲酸和音猬因子，即RA和Shh），并發(fā)現(xiàn)小鼠iPSC衍生的肺間質(zhì)(iLM)表達(dá)了原始發(fā)育肺間質(zhì)的關(guān)鍵分子和功能特征。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)還表明，肺上皮祖細(xì)胞的產(chǎn)量受到肺間質(zhì)的影響，并且影響了上皮和間質(zhì)的分化過(guò)程，這說(shuō)明兩者之間存在功能性相互作用。因此，本研究開(kāi)發(fā)的iPSC群體為研究肺發(fā)育、疾病建模和開(kāi)發(fā)療法提供了豐富可持續(xù)的細(xì)胞來(lái)源。

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• 分離上皮和間充質(zhì)祖細(xì)胞

• 建立小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)/胚胎干細(xì)胞(ESC)系

• 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化為肺間質(zhì)

• 肺間質(zhì)定向分化為更成熟的間質(zhì)譜系

• 工程化肺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)

• 生成類(lèi)器官評(píng)估iLM祖細(xì)胞的功能能力

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肺間充質(zhì)可以通過(guò)定向分化在體外產(chǎn)生

為了開(kāi)發(fā)一種能夠跟蹤和量化早期肺間質(zhì)，獲取假定的肺間質(zhì)特異性體外熒光報(bào)告/示蹤系統(tǒng)，研究人員試圖從改造過(guò)的小鼠中生成一個(gè)iPSC系。為了確保這些小鼠原始肺間質(zhì)的特異性和可見(jiàn)性，研究人員給小鼠注射多西環(huán)素并觀察發(fā)育中的原始肺間質(zhì)在E10處的GFP熒光。接著重新編程小鼠的尾尖成纖維細(xì)胞生成具有正常核型并表達(dá)多能性標(biāo)記的iPSC，并分化為側(cè)板中胚層來(lái)測(cè)試它們的間充質(zhì)能力，發(fā)現(xiàn)RA和Hedgehog (Hh)信號(hào)是有效激活Tbx4-LER所需的最小組合，而成功的肺間質(zhì)分化需要內(nèi)源性Wnt信號(hào)激活。

為了研究RA和Hh信號(hào)對(duì)肺間質(zhì)分化的影響差異，研究人員確定了最佳的RA和PMA濃度，并發(fā)現(xiàn)RA和Hh信號(hào)通路共同促進(jìn)肺間質(zhì)分化以及KDR+側(cè)板中胚層細(xì)胞是Tbx4-LERGFP+肺間質(zhì)的前體細(xì)胞。進(jìn)一步研究表明一部分肺間質(zhì)細(xì)胞成功通過(guò)共同發(fā)育獲得，而側(cè)板中胚層祖細(xì)胞定向分化的肺效率明顯更高。因此，該研究的重點(diǎn)放在了通過(guò)中胚層祖細(xì)胞定向分化肺間質(zhì)的研究上（圖1）。

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圖1

誘導(dǎo)的肺間質(zhì)表達(dá)多個(gè)肺間質(zhì)標(biāo)志物

研究利用scRNA-seq 比較了中胚層祖細(xì)胞定向分化為肺間充質(zhì)過(guò)程中的Tbx4-LERGFP+細(xì)胞（iLM）和Tbx4-LERGFP-細(xì)胞（iLM Neg）的分子表型，并與原代小鼠胚胎肺間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了比較。通過(guò)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)iPSC衍生的細(xì)胞可以劃分為兩個(gè)主要的簇，一個(gè)主要由Tbx4-LERGFP+細(xì)胞組成，另一個(gè)主要由Tbx4-LERGFP-細(xì)胞組成。此外，原代肺間質(zhì)細(xì)胞和iPSC衍生細(xì)胞也顯示出不同的聚類(lèi)模式。

研究發(fā)現(xiàn)，iPSC衍生細(xì)胞在基因表達(dá)方面更接近原代肺間質(zhì)細(xì)胞，并且在肺間質(zhì)分化的早期階段表達(dá)的基因特征還沒(méi)有明顯分化成成熟細(xì)胞。研究人員猜測(cè)并用實(shí)驗(yàn)證明，在肺間質(zhì)分化過(guò)程中，一些GFP譜系追蹤的細(xì)胞短暫地獲得了肺間質(zhì)祖細(xì)胞的狀態(tài)，但隨后失去肺特異性間質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)。他們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，iLM 與 iLM Neg細(xì)胞中的一些標(biāo)記物表達(dá)明顯富集。iLM細(xì)胞和原代肺間質(zhì)細(xì)胞中許多肺間質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)水平相似，但在一部分標(biāo)記物的表達(dá)存在顯著差異。此外，iLM細(xì)胞與對(duì)照組的一般間充質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果表明，基于Tbx4-LER激活的iPSC衍生的工程肺間質(zhì)具有類(lèi)似原代胚胎肺間質(zhì)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄組特征。

最后，研究人員進(jìn)行了共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了肺間質(zhì)分化的重要時(shí)期（圖2-3）。

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圖2

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圖3

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圖4

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圖5

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圖6

誘導(dǎo)肺間充質(zhì)祖細(xì)胞具有發(fā)育能力

該研究嘗試探索iLM細(xì)胞是否能夠分化為更成熟的間充質(zhì)系。他們將iLM 與 iLM Neg細(xì)胞分離并培養(yǎng)在平滑肌分化培養(yǎng)基中。結(jié)果顯示，這兩組細(xì)胞都能夠向間質(zhì)細(xì)胞方向發(fā)展，表達(dá)平滑肌標(biāo)志物。然而，在側(cè)板中胚層狀態(tài)之后的定向肺間充質(zhì)分化過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞能力迅速喪失。這些結(jié)果與之前的研究相符，驗(yàn)證了iLM細(xì)胞具有不同分化潛力的觀點(diǎn)。

誘導(dǎo)肺間質(zhì)與工程化肺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)形成三維類(lèi)器官

該研究中，研究人員建立了肺上皮-間質(zhì)共培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)研究iLM的功能能力。他們分別誘導(dǎo)分化了iLM 細(xì)胞和Nkx2-1+肺上皮祖細(xì)胞并將他們共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，iLM和肺上皮細(xì)胞在共培養(yǎng)后形成了三維類(lèi)器官。此外，與單獨(dú)培養(yǎng)的Nkx2-1mCherry+細(xì)胞相比，與iLM共培養(yǎng)在近端培養(yǎng)條件下顯著提高了Nkx2-1mCherry+細(xì)胞的產(chǎn)量，而與MEF共培養(yǎng)則沒(méi)有（圖3）。

與誘導(dǎo)肺間質(zhì)共培養(yǎng)會(huì)影響上皮分化程序

研究人員繼續(xù)探究了與 iLM 共培養(yǎng)是否可能提供影響分化胚胎干細(xì)胞(ESC)衍生肺上皮細(xì)胞分子表型的信號(hào)，發(fā)現(xiàn)共同培養(yǎng)方式影響了上皮細(xì)胞的分化程序，使得肺上皮細(xì)胞保持在較不成熟的狀態(tài)，表現(xiàn)出更高水平的早期肺上皮標(biāo)記物，而更成熟的遠(yuǎn)端上皮譜系標(biāo)記物表達(dá)水平較低。在近端分化條件下，與iLM共培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)氣道標(biāo)志物增加，而 Nkx2-1 mCherry + 細(xì)胞中發(fā)育后期標(biāo)記物減少。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，與iLM共培養(yǎng)可以部分補(bǔ)償某些生長(zhǎng)因子的去除。（圖4、5a-c）。

共培養(yǎng)誘導(dǎo)非肺上皮祖細(xì)胞向肺上皮細(xì)胞分化

研究發(fā)現(xiàn)，在遠(yuǎn)端分化條件下，與iLM共培養(yǎng)能增加Nkx2-1mCherry+上皮祖細(xì)胞的數(shù)量和產(chǎn)量。研究者進(jìn)一步嘗試確定iLM是否能在ESC來(lái)源的內(nèi)胚層培養(yǎng)中積極誘導(dǎo)肺上皮的發(fā)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在與iLM共培養(yǎng)之前，不論細(xì)胞是Nkx2-1mCherry+還是Nkx2-1mCherry-，任何Nkx2-1mCherry+細(xì)胞的肺上皮譜系標(biāo)記的表達(dá)都無(wú)差異。此外，研究者還測(cè)試了iLM細(xì)胞的功能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明iLM可以支持工程和原代肺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖5d-i）。

共同培養(yǎng)中的上皮-間充質(zhì)細(xì)胞相互作用影響間質(zhì)細(xì)胞的分化

研究人員量化了共培養(yǎng)前后iLM細(xì)胞中肺間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)以及與 ESC 衍生的 Nkx2-1?mCherry??+ (Ch + ) 肺上皮共培養(yǎng)后MEF中的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在遠(yuǎn)端培養(yǎng)基中與Nkx2-1mCherry+肺上皮共培養(yǎng)，導(dǎo)致Wnt2、Tbx4、Pdgfra和Acta2僅在iLM中上調(diào)，而在MEF中沒(méi)有上調(diào)，并且Col1a1表達(dá)在所有條件下均升高，而肺間充質(zhì)祖細(xì)胞標(biāo)志物Foxf1下調(diào)。研究還發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)的iLM向間充質(zhì)肺泡壁細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞分化，而不是向血管平滑肌細(xì)胞分化。這些發(fā)現(xiàn)表明，在共培養(yǎng)中肺上皮細(xì)胞可能對(duì)維持、增強(qiáng)或成熟的iLM的肺特異性特征起著重要作用（圖6）。

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這項(xiàng)研究利用小鼠iPSC生成肺間充質(zhì)祖細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們具有與原代胚胎肺間充質(zhì)相似的轉(zhuǎn)錄特征，并能成熟分化。研究人員還建立了類(lèi)器官模型評(píng)估工程化肺間充質(zhì)的功能能力，發(fā)現(xiàn)重組增強(qiáng)了肺上皮細(xì)胞的規(guī)格和產(chǎn)量，并對(duì)兩個(gè)系的分子表型產(chǎn)生影響，表明了上皮和間充質(zhì)之間存在功能性交叉。

綜上所述，這項(xiàng)研究為肺發(fā)育和疾病研究提供了新的思路，并為治療方法的開(kāi)發(fā)提供了新的方向。

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