神經(jīng)膠質(zhì)細胞

神經(jīng)組織的細胞類型大體分為兩類：神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞；神經(jīng)元細胞是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，神經(jīng)膠質(zhì)細胞包括分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，以及分布在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的施萬細胞和位于脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)的衛(wèi)星細胞等。

表1 神經(jīng)膠質(zhì)細胞的主要分類及形態(tài)和功能

由于神經(jīng)性疾病臨床癥狀復雜，病因難以判斷，神經(jīng)細胞損傷后難以再生以及血腦屏障對藥物輸送的限制，采用藥物和機械性手術治療不僅難度高，且治療效果有限，無法根治。因此，研究人員著眼于內(nèi)源性途徑尋找治療方法，通過研究發(fā)病機制，確認關鍵基因靶點，采用基因治療法從根本上治療疾病，恢復患者的神經(jīng)功能。腺相關病毒（AAV）因其獨有的特點，是目前基因治療的重要載體之一。那么如何用AAV去靶向神經(jīng)膠質(zhì)細胞呢？本文將詳細介紹針對不同種類的膠質(zhì)細胞，從血清型和特異性啟動子兩個方面詳細介紹利用AAV載體實現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性基因調(diào)控的策略，并結(jié)合相關案例進行注射方式的介紹，希望能夠為做相關研究的老師提供幫助。

一、血清型選擇

AAV有多種血清型，目前已發(fā)現(xiàn)有至少12種野生血清型以及100多種變體，其區(qū)別主要在于Cap基因（編碼衣殼蛋白）的不同。不同的血清型對不同的組織或器官親和性不同，從而導致對不同的組織和細胞感染效率不同，這對研究不同的疾病提供了方便性和可選性?？梢酝ㄟ^對編碼cap基因的 RC質(zhì)粒進行改造，獲得不同血清型的RC質(zhì)粒。在包裝病毒時，將RC質(zhì)粒、helper質(zhì)粒以及含有目的基因的AAV表達質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染293細胞，獲得不同血清型的重組AAV病毒顆粒（rAAV）。

Cearley和Wolfe兩位學者研究發(fā)現(xiàn)AAV9可將載體基因組運輸?shù)竭h端神經(jīng)元細胞。Foust等研究發(fā)現(xiàn)在小鼠中靜脈注射AAV9，可以有效地靶向小鼠的大腦和脊髓。之后越來越多的研究表明AAV9是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中實現(xiàn)基因穩(wěn)定表達最合適的血清型。漢恒生物的實驗室對AAV9進行了轉(zhuǎn)導測試，效果見圖1。

圖1 腦區(qū)基因轉(zhuǎn)導(圖片來源于漢恒生物）

神經(jīng)性疾病研究的難點之一是血腦屏障（Blood–Brain Barrier，BBB）的存在，BBB是一種大腦血管、細胞以及其它組成大腦組織之間的保護性屏障，能為大腦提供一種防御機制來抵御血液中的外來病原體和毒素等。漢恒生物研發(fā)出了可穿過血腦屏障的AAV-BBB，尾靜脈注射小鼠即可達到感染全腦的效果，詳見圖2。

圖2 漢恒AAV/BBB病毒注射小鼠尾靜脈可突破血腦屏障感染腦組織

（圖片來源于漢恒生物）

除此之外，漢恒生物也有AAV-cap-B10，可以更高效的穿越血腦屏障。如圖3所示，發(fā)表在《Nat Neurosci》雜志上題為 “AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset”的文章，AAV-cap-B10病毒通過尾靜脈注射可以高效的感染神經(jīng)細胞而在同時對肝臟組織沒有感染效果。

圖3 在狨猴中，AAV-cap-B10特異性靶向神經(jīng)細胞而非肝臟細胞

不僅如此，漢恒生物還有專注于神經(jīng)小膠質(zhì)細胞的血清型AAV-MG及其增強型AAV-MG1.2。如圖4所示，發(fā)表在《Nat Methods》雜志上題為 “Directed evolution of adeno-associated virus for efficient gene delivery to microglia”的文章，AAV-MG1.2病毒通過尾靜脈注射可以高效的感染小膠質(zhì)細胞。

圖4 AAV-MG1.2特異性靶向小膠質(zhì)細胞

表2 神經(jīng)組織特異性血清型

上表所列是漢恒生物提供的用于神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控的特異性血清型，并有試用裝可供試用，歡迎咨詢試用。

特異性啟動子

特異性血清型AAV可以靶向不同組織實現(xiàn)組織特異性感染，然而利用特異性血清型靶向的范圍仍然較寬，且特異性血清型種類較少，如果想要在某種特定細胞上實現(xiàn)基因表達調(diào)控，僅使用不同的特異性血清型是難以實現(xiàn)的，而不同組織特異性啟動子就比較豐富，漢恒生物針對各種神經(jīng)膠質(zhì)細胞類型推出了多種特異性啟動子，可構(gòu)建高效、特異性靶向不同細胞類型的rAAV載體。

表3 神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性啟動子

上表所列是漢恒生物提供的用于神經(jīng)膠質(zhì)特異性表達調(diào)控的啟動子，并有試用裝可供試用，歡迎咨詢試用。

星形膠質(zhì)細胞特異性啟動子

作為星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的主要骨架蛋白，GFAP在細胞核和細胞膜之間形成連接，參與細胞內(nèi)細胞骨架重組、細胞黏附、維持腦內(nèi)髓鞘形成和神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)以及作為細胞信號參與轉(zhuǎn)導通路等，具有維護星形膠質(zhì)細胞形態(tài)穩(wěn)定、參與血腦屏障形成、調(diào)節(jié)突觸等功能，因此GFAP可以作為星形膠質(zhì)細胞特異性標志物。

如圖5-6所示，是漢恒生物客戶發(fā)表在《PAIN》雜志上題為“Astrocytic phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 regulates neuropathic pain by facilitating 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase–dependent cholesterol biosynthesis”的文章，通過鞘內(nèi)注射AAV2/9-GFAP-r-PTEN-3Flag 和AAV2/9-GFAP-r-HMGCR-3Flag的AAV病毒，實現(xiàn)基因在星型膠質(zhì)細胞特異性表達PTEN和HMGCR。

圖5 GFAP特異性啟動PTEN 基因在星型膠質(zhì)細胞表達

圖6 GFAP特異性啟動HMGCR基因 在星型膠質(zhì)細胞表達

小膠質(zhì)細胞特異性啟動子

小膠質(zhì)細胞（microglia）是存在于大腦和脊髓中的巨噬細胞，在神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細胞不斷清除斑塊、受損的神經(jīng)元和傳染性物質(zhì)，是主動免疫防御的主要形式?，F(xiàn)在一般采用CD68、F4/80、iba1、TMEM119啟動子作為小膠質(zhì)細胞特異性啟動子。

如圖7所示，發(fā)表在《Molecular Therapy — Methods & Clinical Development》雜志上題為“Microglia-specific targeting by novel capsid-modified AAV6 vectors”的文章，通過腦室注射AAV- CD68-GFP和AAV- F4/80-GFP病毒，可以特異性的感染小膠質(zhì)細，但同時對神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞沒有感染效果。

圖7 CD68和F4/80啟動子在小膠質(zhì)細胞中特異性表達

如圖8所示，發(fā)表在《COMMUNICATIONS BIOLOGY》雜志上題為 “Development of microglia-targeting adenoassociated viral vectors as tools to study microglial behavior in vivo”的文章，AAV/9 –iba1-GFP病毒可以特異性的感染小鼠大腦皮層小膠質(zhì)細胞。

圖8 iba1啟動子在小膠質(zhì)細胞中特異性表達

如圖9所示，發(fā)表在《Annals of Translational Medicine》雜志上題為“Role of spindle pole body component 25 in neurodegeneration”的文章，AAV/ PHP.B -pTMEM-shSPC25病毒可以特異性的感染小鼠小膠質(zhì)細胞HMC3，但同時對小鼠神經(jīng)元細胞HCN-2，小鼠巨噬細胞RAW264.7和小鼠成纖維細胞3T3沒有感染效果。

圖9 TMEM119啟動子在小膠質(zhì)細胞HMC3中特異性干擾spc25表達

少突膠質(zhì)細胞特異性啟動子

CNP特異性啟動子是2',3'-cyclic nucleotide 3' phosphodiesterase（2'，3'-環(huán)核苷酸3'磷酸二酯酶）基因的啟動子，可以作為少突膠質(zhì)細胞或施萬細胞特異性啟動子。如圖10所示，發(fā)表在《THE JOURNAL OF GENE MEDICINE》雜志上題為“Gene delivery targeted to oligodendrocytes using a lentiviral vector”的文章，因為CNP特異性啟動子比較長達到2KB，以及AAV包裝容量的有限性，文章選擇使用慢病毒作為基因遞送的載體。新生鼠大腦注射LV-CNP-GFP，發(fā)現(xiàn)CNP啟動子可以特異性的在少突膠質(zhì)細胞（CC1和Olig2）表達，但同時對神經(jīng)元（NeuN），神經(jīng)膠質(zhì)細胞（GFAP）和小膠質(zhì)細胞（CD11b）沒有感染效果。

圖10 CNP啟動子在少突膠質(zhì)細胞中特異性表達

MBP特異性啟動子是myelin basic protein（髓鞘基質(zhì)蛋白）基因的啟動子，經(jīng)典MBP基因編碼的蛋白是神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細胞的主要成分，因此MBP啟動子可以作為少突膠質(zhì)細胞特異性啟動子。如圖11所示，發(fā)表在《BRAIN》雜志上題為“Gene therapy targeting oligodendrocytes provides therapeutic benefit in a leukodystrophy model”的文章，使用AAV.MBP.Cx47myc及其對照病毒AAV.MBP.EGFP作為基因遞送的載體。腦立體定位注射病毒至出生10天的小鼠腦內(nèi)囊區(qū)，發(fā)現(xiàn)MBP啟動子可以特異性的在少突膠質(zhì)細胞（CC1）表達，但同時對神經(jīng)元（NeuN），神經(jīng)膠質(zhì)細胞（GFAP）和小膠質(zhì)細胞（iba1）沒有感染效果。

圖11 MBP啟動子在少突膠質(zhì)細胞中特異性表達

AAV注射方式

在神經(jīng)研究中，我們常常采用腦立體定位注射、側(cè)腦室注射、尾靜脈注射等不同的注射方式。腦立體定位注射可根據(jù)不同的坐標感染特定的腦區(qū)，尾靜脈注射感染范圍較廣，可結(jié)合漢恒生物跨血腦屏障血清型（AAV/BBB）感染全腦。

腦立體定位注射是神經(jīng)研究中最常用的一種注射方式，如圖12所示，是漢恒生物客戶發(fā)表在《Advanced Science》雜志上題為“Genetic and Pharmacological Inhibition of Astrocytic Mysm1 Alleviates Depressive-Like Disorders by Promoting ATP Production”的文章，使用三種啟動子啟動的cre病毒AAV-CMV-Cre, AAV-GFAP-Cre, AAV-hSynCre，腦立體定位注射至小鼠MHb和HIP和IC腦區(qū)，以實現(xiàn)特異性的基因敲除。

圖12 腦立體定位注射cre病毒

此外，還可以通過尾靜脈注射可以穿透血腦屏障的AAV來達到感染全腦的目的。https://www.hanbio.net/academic/尾靜脈注射視頻資料，可以下載學習觀看。

至此，本期內(nèi)容就結(jié)束了，主要從AAV的血清型、啟動子及注射方式三個方面介紹了特異性調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)細胞的策略，相信大家對AAV在神經(jīng)膠質(zhì)細胞領域的應用有了一個初步的了解，在下期的內(nèi)容中我們將會繼續(xù)分享在腎臟疾病方面的特異性基因調(diào)控策略。最后，歡迎大家關注漢恒生物公眾號獲取更多動物注射視頻資料。

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