雙鏈DNA（dsDNA）作為病原體入侵和細(xì)胞受損的信號，可激活機(jī)體的固有免疫反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)dsDNA的主要傳感器之一是環(huán)狀GMP-AMP合酶（cGAS），它以ATP和GTP為底物合成cGAMP。cGAMP作為第二信使，激活干擾素基因刺激因子（STING）?；罨腟TING從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運，并激活TANK結(jié)合激酶1（TBK1）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3），從而促進(jìn)干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄，最終形成抗感染的免疫應(yīng)答。STING的異常激活與自身免疫性疾病和炎癥性疾病有關(guān)。因此，揭開STING的作用機(jī)制對于開發(fā)抗感染、抗腫瘤以及自身免疫性疾病的療法至關(guān)重要。之前的多項研究揭開了STING的激活機(jī)制，但對STING的自我抑制機(jī)制仍知之甚少。

近日，山西高等創(chuàng)新研究院尚桂軍團(tuán)隊、盧德芬團(tuán)隊與中科院微生物所高福團(tuán)隊、南方科技大學(xué)王培毅團(tuán)隊合作，深入分析了STING的自我抑制和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留機(jī)制。這篇發(fā)表在《Molecular Cell》上的論文描繪了一幅STING自我抑制和激活的全景圖，大大加深了對cGAS-STING信號通路的了解。

研究材料與方法

在這項研究中，研究人員表達(dá)了多個物種（包括人類、小鼠、豬和雞）的STING蛋白質(zhì)，并通過冷凍電鏡（Cryo-EM）分析了全長STING聚合物的結(jié)構(gòu)。在分析某個氨基酸的改變對STING蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性時，作者使用了多株基于CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建的THP-1/STING點突變細(xì)胞系，來模擬STING內(nèi)源性突變對STING蛋白結(jié)構(gòu)影響，THP-1/STING點突變細(xì)胞系由賽業(yè)生物提供。

技術(shù)路線

01

通過冷凍電鏡等技術(shù)對apo-STING寡聚體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征

02

通過共聚焦顯微鏡和突變分析來確定apo-STING中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)

03

通過晶體堆積和冷凍電鏡分析來確定STING-cGAMP的結(jié)構(gòu)

04

比較STING在靜息和活化狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)

研究結(jié)果

1

apo-STING在LBD介導(dǎo)下形成雙層結(jié)構(gòu)

STING由N端的跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）和C端的胞質(zhì)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD）組成。以往的研究發(fā)現(xiàn)，STING定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，以同源二聚體的形式存在，而LBD處于開放狀態(tài)。與cGAMP結(jié)合后，STING的LBD相對于TMD順時針旋轉(zhuǎn)180°，并形成一個蓋子結(jié)構(gòu)，將配體包在其中。分析還發(fā)現(xiàn)活化的STING形成更高階的寡聚體，但STING-cGAMP復(fù)合物組裝的細(xì)節(jié)仍不清楚。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留對維持STING的非活性狀態(tài)至關(guān)重要，而STING的異常轉(zhuǎn)運會導(dǎo)致其以不依賴配體的方式激活。由于STING沒有明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號，STIM1蛋白被認(rèn)為是STING的結(jié)合伙伴，使其滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。近年來報道了幾例嬰兒STING相關(guān)血管病變（SAVI）患者，他們的STING被組成型激活。于是，研究人員想了解STING如何被抑制以及如何滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

研究人員首先通過非變性凝膠電泳（native PAGE）實驗，發(fā)現(xiàn)多個物種的STING在靜息狀態(tài)下以寡聚體形式存在。apo-STING（未結(jié)合配體的）寡聚體在非變性膠中不穩(wěn)定，而cGAMP刺激能夠提高STING寡聚體的穩(wěn)定性。通過冷凍電鏡分析，他們發(fā)現(xiàn)apo-STING表現(xiàn)出一種頭對頭和肩并肩的雙層結(jié)構(gòu)，像拉鏈一樣將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩層膜連在一起（圖1）。此外，這種類型的STING組裝也出現(xiàn)在雞、牛和豬等其他物種中，表明這種組裝方式在進(jìn)化上是保守的。

通過對寡聚體結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步分析，研究人員發(fā)現(xiàn)只有每個STING二聚體的LBD介導(dǎo)了相互作用，而TMD沒有參與，彼此之間的距離約為15A°。LBD α2螺旋與α3螺旋之間的環(huán)（LBDα2-α3 loop）介導(dǎo)了apo-STING寡聚體的肩并肩組裝。有研究表明位于STING二聚體的突變會以推動LBD的旋轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致STING的異常激活，而引入外源點突變的STING很難解釋這種現(xiàn)象，為了更好的確認(rèn)這些位點突變的影響，作者委托賽業(yè)生物進(jìn)行THP-1/STING點突變細(xì)胞株的構(gòu)建，模擬STING內(nèi)源突變是否導(dǎo)致會以不依賴cGAMP的方式激活STING。

將Q273殘基突變?yōu)镋273殘基后，研究人員發(fā)現(xiàn)STING通路的基礎(chǔ)磷酸化水平要高得多，且IFN-β活性升高，即使沒有cGAMP的刺激，STING foci的形成也會增加。當(dāng)S275突變?yōu)镹275時，蛋白變體在沒有cGAMP的情況下變得高度激活，表明這一替換極大破壞了STING自我抑制構(gòu)象的穩(wěn)定性。這些結(jié)果顯示，LBDα2-α3 loop在維持STING的自我抑制方面起著重要作用。

在頭對頭的STING相互作用中，由殘基L230和P231組成的疏水性LP motif發(fā)揮了關(guān)鍵作用。令人驚訝的是，他們發(fā)現(xiàn)非活性狀態(tài)的STING采用了一種封閉構(gòu)象，帶有一個蓋子，與以往的開放構(gòu)象形成了鮮明的對比。其中，一個單體內(nèi)的LP motif由于翻轉(zhuǎn)90°導(dǎo)致蓋子區(qū)域內(nèi)經(jīng)典LBDβ2-β3 loop中的返回鏈與非經(jīng)典LBDβ2-β3 loop中的起始鏈之間形成平行β折疊片層結(jié)構(gòu)，而不同于結(jié)合cGAMP后的反平行β折疊片層結(jié)構(gòu)（圖2）。這種由LP motif和LBD的疏水裂隙介導(dǎo)的頭對頭相互作用將STING的兩層粘在一起。

2

STING-cGAMP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)

此外，通過晶體堆積分析和冷凍電鏡研究，研究人員發(fā)現(xiàn)STING-cGAMP復(fù)合物通過肩并肩堆積形成了多聚結(jié)構(gòu)（圖3）。高分辨率的電鏡圖像顯示，STING-cGAMP復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)從側(cè)面看呈彎曲狀。其他多個物種的STING-cGAMP復(fù)合物結(jié)構(gòu)也類似，表明這種構(gòu)象在進(jìn)化上是保守的。相鄰的STING二聚體之間的相互作用不僅發(fā)生在LBD上，也存在于TMD之間。

3

STING非活化和活化狀態(tài)的結(jié)構(gòu)比較

根據(jù)前面的分析，STING在靜息和活化狀態(tài)下都能形成寡聚體，明顯的區(qū)別在于，自我抑制的STING形成了雙層絲狀結(jié)構(gòu)，而活化的STING則形成彎曲的單層絲狀結(jié)構(gòu)。STING的靜息狀態(tài)是由LBD通過順式和反式的頭對頭和肩并肩堆積來維持的，而STING的活化狀態(tài)則僅通過順式LBD和TMD的相互作用來穩(wěn)定。盡管STING的兩種狀態(tài)都采用封閉構(gòu)象，但這兩個蓋子的構(gòu)象是不同的（圖2）。

在比較兩種狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)后，研究人員認(rèn)為彎曲的STING寡聚體可以使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜變形，并推動STING向前運輸。相比之下，在靜息狀態(tài)下，STING的雙層結(jié)構(gòu)讓兩層平行的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜緊密接觸，使得STING滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。這些結(jié)果表明，apo-STING寡聚體結(jié)構(gòu)代表了STING的自我抑制狀態(tài)，而LBD在維持其自我抑制方面起了重要作用。

研究結(jié)論

綜上所述，研究人員發(fā)現(xiàn)apo-STING在靜息狀態(tài)下形成雙層結(jié)構(gòu)的寡聚體，將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的兩層膜連在一起，STING據(jù)此完成了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留和自我抑制?；罨腟TING則采用彎曲的構(gòu)象，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜變形，便于其前向運輸。這種自我抑制和活化的結(jié)構(gòu)為人們了解STING的生理和病理作用提供了大量信息，并為合理設(shè)計藥物以控制STING活性提供了可能。

原文檢索：

[1]Liu S, Yang B, Hou Y, Cui K, Yang X, Li X, Chen L, Liu S, Zhang Z, Jia Y, Xie Y, Xue Y, Li X, Yan B, Wu C, Deng W, Qi J, Lu D, Gao GF, Wang P, Shang G. The mechanism of STING autoinhibition and activation. Mol Cell. 2023 May 4;83(9):1502-1518.e10. doi: 10.1016/j.molcel.2023.03.029.

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