第一章緒論

1.生物藥物的四種類型：應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造的基因多肽、蛋白質(zhì)類治療劑；基因藥物，如基因治療劑、基因疫苗、反義藥物和核酶；來自動物、植物和微生物的天然生物藥物；合成與部分合成的生物藥物。

2.生物技術(shù)藥物：采用DNA重組技術(shù)或其他生物新技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸類藥物。

3.生物技術(shù)藥物的特性：

1)分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜

2)具有種屬特異性

3)治療針對性強(qiáng)、療效高

4)穩(wěn)定性差

5)基因穩(wěn)定性較為重要

6)可能具有免疫原性

7)體內(nèi)的半衰期短

8)受體效應(yīng)，即組織特異性和藥效反應(yīng)快

9)具有多效性和網(wǎng)絡(luò)性效應(yīng)

10)檢驗具有特殊性

第二章基因工程制藥

1.基因工程技術(shù)：將所要重組對象的目的基因插入載體、拼接、轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌(或細(xì)胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌(或細(xì)胞）內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。

2.反轉(zhuǎn)錄法獲得目的基因的步驟：

總RNA的提?。籱RNA的純化；cDNA第一鏈的合成；引物設(shè)計與合成（注意在引物兩端適當(dāng)引入酶切位點或其他載體構(gòu)建所用到的DNA序列）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。

3.克隆載體的三個核心組成包括：復(fù)制起始位點、篩選標(biāo)記、基因插入位點。表達(dá)載體比克隆載體多出與轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的元件，如啟動子、終止子、非編碼區(qū)、核糖體結(jié)合位點等。

4.基因表達(dá)：指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。

5.生物工程宿主菌所滿足的要求：

1)培養(yǎng)容易、生長快速：

2)容易獲得較高濃度的細(xì)胞：

3)能利用易得廉價原料：?

4)不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素：

5)發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度：

6)容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作：

7)產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高：

8)產(chǎn)物容易提取純化：

6.常用的原核表達(dá)宿主菌有：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和鏈霉菌。

7.常用的真核表達(dá)宿主有：酵母、絲狀真菌、動物和植物。

8.論述大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞作為宿主的優(yōu)缺點

大腸桿菌：基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系。

? 優(yōu)點：生長快速、代謝簡單、遺傳體系清楚、容易操作、細(xì)胞破碎容易。

? 缺點： ① 不存在導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號序列，分泌能力不足，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難； ②蛋白表達(dá)后不能修飾加工（糖基化等）； ③產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個蛋氨酸殘基，能引起免疫反應(yīng)； ④內(nèi)毒素存留。?

哺乳動物細(xì)胞

? 優(yōu)點：表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，純化容易。產(chǎn)物是糖基化的接近天然物。

? 缺點：生長慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度稀。

9.電擊法轉(zhuǎn)化：

將重組質(zhì)粒與電擊感受態(tài)細(xì)胞混勻，在一定離子強(qiáng)度下加高壓電場。離子在電場中運動，使細(xì)胞穿孔，重組質(zhì)粒在離子運動的帶動下進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞中。

10.熱擊法轉(zhuǎn)化：

利用陽離子（如鈣離子）覆蓋細(xì)胞膜和重組質(zhì)粒上的負(fù)電性，消除兩者之間的排斥力的同時將兩者粘附在一起。在熱擊處理后迅速放回冰上，可實現(xiàn)質(zhì)粒向感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。原理可能是熱擊處理使細(xì)胞瞬間膨脹穿孔，收縮后將質(zhì)粒吞入。也可能是放回冰上后胞內(nèi)溫度與胞外溫度差太大，出現(xiàn)液體的熱循環(huán)，從而將質(zhì)粒送入感受態(tài)細(xì)胞中。

11.簡述堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理

堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 與線性染色體DNA 在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在pH 值介于12.0 ～12.5 這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA 的氫鍵會被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH 4.8 的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH 至中性時，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA 的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA 的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA ，蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。

答案亦可繪制下圖，并在旁注釋說明：

12.結(jié)合插圖說明藍(lán)白斑篩選的原理：

一些載體（如PUC系列質(zhì)粒）帶有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的編碼區(qū)，該編碼區(qū)中含有多克隆位點（MCS），可用于構(gòu)建重組子[3]? 。這種載體適用于僅編碼β-半乳糖苷酶C端ω片段的突變宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有半乳糖苷酶活性，但它們同時存在時，α片段與ω片段可通過α-互補(bǔ)形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實現(xiàn)了互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍(lán)色菌落。而當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地破壞α片段的編碼，使得帶有重組質(zhì)粒的LacZ-細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，稱為藍(lán)白斑篩選。

13.依照下圖，簡述Lac/T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)粒細(xì)胞集落刺激因子的原理

T7啟動子來源于λ噬菌體，其可以被T7 RNA聚合酶專一性結(jié)合和啟動。T7 RNA聚合酶被整合入宿主的基因組中[如BL21(DE3)菌株]，受到Lac啟動子的調(diào)控。LacI抑制蛋白抑制T7 RNA聚合酶基因的表達(dá)。當(dāng)加入IPTG（乳糖類似物）后可解除這種抑制，表達(dá)出來的T7 RNA聚合酶可以結(jié)合到表達(dá)載體上的T7啟動子上，從而轉(zhuǎn)錄G-CSF基因的表達(dá)，最終合成產(chǎn)物G-CSF。

這種雙重調(diào)節(jié)，可以避免Lac啟動子的泄漏表達(dá)，從而降低重組蛋白的本底表達(dá)水平。

14.簡述表達(dá)載體需具備的條件：

（1）載體能獨立地進(jìn)行復(fù)制 (復(fù)制起點，ori)

（2）應(yīng)具有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記

（3）應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識別

（4）應(yīng)具有阻遏子

（5）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子

（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號

15.簡述影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素

⑴外源基因的劑量

⑵外源基因的表達(dá)效率：①啟動子和終止子的強(qiáng)弱；②核糖體結(jié)合位點的有效性；③ SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離；④密碼子組成

⑶表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性

⑷細(xì)胞代謝負(fù)荷

⑸工程菌的培養(yǎng)條件

16.真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)位置主要有：細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)空間和培養(yǎng)基。

17.根據(jù)來自酵母的復(fù)制序列的構(gòu)成和特性不同，酵母表達(dá)載體分為以下四類：附加體質(zhì)粒類載體、復(fù)制型質(zhì)粒類載體、著絲粒質(zhì)粒類載體和整合型質(zhì)粒類載體。

18.舉一個酵母表達(dá)載體的例子，并繪制該表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)。說明各個元件的作用。

19.闡述重組法酵母轉(zhuǎn)基因的原理與操作流程！

20.簡述影響目的基因在酵母中表達(dá)的因素

⑴ 外源基因的劑量

⑵ 外源基因的表達(dá)效率?

①啟動子強(qiáng)度

?、诜置谛盘柕男?/p>

　③終止序列的影響

⑶ 外源蛋白的糖基化

外源蛋白經(jīng)釀酒酵母糖基化后，可靠有效地以活性型分泌到培養(yǎng)基中；某些蛋白質(zhì)糖基化后更加穩(wěn)定，便于分離精制。

⑷ 宿主菌株的影響

?、倬w生長力強(qiáng)?

　②菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱?

?、劬w性能穩(wěn)定?

?、芊置谀芰?qiáng)

21.比生長速率:菌體生長速率與培養(yǎng)基中菌體濃度之比。

22.嚴(yán)緊反應(yīng)：當(dāng)細(xì)菌發(fā)現(xiàn)它們處于很差的生長環(huán)境，沒有足夠的氨基酸來維持蛋白質(zhì)合成時，它們就會停止大部分活動，這種現(xiàn)象稱為嚴(yán)緊反應(yīng)。

23.基因工程菌的不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。

24.簡述提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法。

1)選擇合適的宿主菌

2)選擇合適的載體

3)施加選擇壓力

4)分階段控制培養(yǎng)

5)控制培養(yǎng)條件

6)固定化

25.大腸桿菌培養(yǎng)工藝中值得優(yōu)化的地方有哪些：

培養(yǎng)基：碳源；無機(jī)磷（增加基質(zhì)，優(yōu)化營養(yǎng)物質(zhì)種類和配比）

接種量：與生長速率適應(yīng)

溫度：魔斑；mRNA濃度；蛋白活性和包含體生成

溶解氧：細(xì)胞生長；低于20%產(chǎn)生雜蛋白（提高氧分壓；血紅蛋白基因引入；與小球藻混合培養(yǎng)）

pH：生長最佳7.0，生產(chǎn)最佳pH與之不同時注意及時調(diào)整

誘導(dǎo)時機(jī)：對數(shù)生長期或后期，同時注意營養(yǎng)和氧氣的供應(yīng)

誘導(dǎo)表達(dá)程序：升溫時間長，熱激蛋白含量升高，目的蛋白則減少——熱蒸汽處理2min左右！

26.基因工程菌的培養(yǎng)方式：

1、分批培養(yǎng)：培養(yǎng)基的量一次性加入，產(chǎn)品一次性收獲,分批培養(yǎng)操作簡單，但因不能控制生長，獲得的菌體密度也有限。

2、補(bǔ)料分批培養(yǎng)：在一次投料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，流加一定量的營養(yǎng)，使細(xì)胞進(jìn)一步的生長，可得到更多的代謝產(chǎn)物。

3、連續(xù)培養(yǎng)：不斷地流加營養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。連續(xù)培養(yǎng)則多用于動力學(xué)特性和穩(wěn)定性等研究。

4、透析培養(yǎng)

5、固定化培養(yǎng)

27.補(bǔ)料分批培養(yǎng)（流加式培養(yǎng)）

指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜的條件下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物不斷形成，而在此過程中隨著營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，不斷地向系統(tǒng)中補(bǔ)充新的營養(yǎng)成分，使細(xì)胞進(jìn)一步生長代謝，直到整個培養(yǎng)結(jié)束后取出產(chǎn)物。

28.補(bǔ)料分批培養(yǎng)（流加式培養(yǎng)）的優(yōu)缺點

優(yōu)點：由于只有料液的輸入，沒有輸出，因此發(fā)酵液的體積在增加。與分批發(fā)酵相比，通過向培養(yǎng)系統(tǒng)中補(bǔ)充物料，可以使培養(yǎng)液中的底物濃度較長時間的保持在一定的范圍內(nèi)，既保證了菌體細(xì)胞的生長需要，又不造成阻遏抑制等不良影響，從而達(dá)到提高產(chǎn)物濃度的得率的目的。

缺點：容易造成產(chǎn)物的積累，容易染菌，而且中間補(bǔ)料會造成發(fā)酵液的稀釋。?

29.連續(xù)式培養(yǎng)

是指將細(xì)胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮的培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)器液連續(xù)不斷地取出，使反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。?

30.連續(xù)式培養(yǎng)的優(yōu)缺點：

優(yōu)點: 操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，而且可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。能夠更有效的實現(xiàn)機(jī)械化和自動化，降低勞動強(qiáng)度；減少設(shè)備清洗，準(zhǔn)備和滅菌等非生產(chǎn)占用時間，提高設(shè)備利用率。

缺點：首先放掉發(fā)酵液的同時會損壞未被利用的營養(yǎng)物質(zhì)和正處于代謝活躍狀態(tài)的菌體細(xì)胞。其次中間補(bǔ)料會造成發(fā)酵液的稀釋，增加下游提取液的體積，再次，發(fā)酵液中一些由代謝產(chǎn)生的前體有可能丟失，造成發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。對設(shè)備、儀器及控制元件的技術(shù)要求較高。粘性絲狀菌菌體容易附著在器壁上生長或發(fā)酵液內(nèi)結(jié)團(tuán)，帶來操作困難。此外，染菌問題也是影響發(fā)酵過程能否進(jìn)行的重要因素總之，連續(xù)發(fā)酵營養(yǎng)物利用率低于單批培養(yǎng)，一般只能維持?jǐn)?shù)月至一年。

31.灌流式培養(yǎng)

是把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。

32.灌流式培養(yǎng)的優(yōu)缺點：

優(yōu)點：

?①細(xì)胞可處在較穩(wěn)定的良好的環(huán)境中，有害代謝物濃度低；

?②可極大地提高細(xì)胞密度，從而極大地提高了產(chǎn)品產(chǎn)量

?③產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間縮短，可及時收留在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高；

?④培養(yǎng)基的比消耗率較低，加之產(chǎn)量質(zhì)量的提高，生產(chǎn)成本明顯降低。

缺點：此方法最大困難是污染機(jī)率較高。

33.發(fā)酵罐的組成部分有：

1)發(fā)酵罐體

2)保證高傳質(zhì)作用的攪拌器、

3)精細(xì)的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、

4)空氣無菌過濾裝置

5)殘留氣體處理裝置

6)參數(shù)測量與控制系統(tǒng)（如 pH、O2、CO2 等）

7)培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置等。

34.高密度發(fā)酵是一個相對概念，一般是指培養(yǎng)液中工程菌的菌體濃度在50 gDCW/L以上，最高值可達(dá)200 gDCW/L。

35.包含體：重組蛋白在大腸桿菌中的高水平表達(dá)經(jīng)常導(dǎo)致蛋白聚集，所形成的這種不溶的、無活性的聚集體稱為包含體。

36.基因工程藥物的質(zhì)量控制包括：生物材料、培養(yǎng)過程、純化過程和目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

37.簡述蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品的質(zhì)量控制要點

1. 生物活性測定

2. 理化性質(zhì)測定

（1）非特異性鑒別

（2）特異性鑒別

（3）相對分子量的測定：

（4）pI測定：

（5）肽圖分析

（6）氨基酸成分分析：

（7）部分氨基酸序列分析：

（8）蛋白質(zhì)二硫鍵分析

3. 蛋白質(zhì)含量

4. 蛋白質(zhì)純度分析

5. 雜質(zhì)檢測

6. 穩(wěn)定性考查

7. 產(chǎn)品一致性的保證

38.蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品的液態(tài)保存方法有：低溫保存、在穩(wěn)定pH下保存、高濃度保存和加保護(hù)劑保存。

第三章動物細(xì)胞工程制藥

2.用于生產(chǎn)的動物細(xì)胞的類型有：原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、融合細(xì)胞系和基因工程細(xì)胞系。

3.動物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類包括：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。

4.消化分離法：消化分離法是先從生物體取來組織塊，將其剪碎，并用消化液將其消化，使組織松散成細(xì)胞懸液，然后用緩沖液洗滌、離心、去除殘留的消化液而獲得所需細(xì)胞。

5.體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長條件：

環(huán)境無毒和無菌；適宜的溫度；一定的氣體環(huán)境和pH值；一定的滲透壓；充足的營養(yǎng)物質(zhì)。

6.動物細(xì)胞的生理特點：

分裂周期長；絕大多數(shù)細(xì)胞需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制或密度抑制現(xiàn)象；正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的；動物細(xì)胞對周圍環(huán)境十分敏感；對培養(yǎng)基要求高；蛋白質(zhì)合成途徑與修飾功能與細(xì)菌不同。

7.原代培養(yǎng)期：

也稱初代培養(yǎng)期，指從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代的階段，一般持續(xù)1-4周。此期細(xì)胞移動比較活躍，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛；細(xì)胞形狀與體內(nèi)細(xì)胞相似性大。

8.傳代（細(xì)胞系）：原代細(xì)胞生長一定時間后，貼壁型細(xì)胞就會連接成片而鋪滿整個支持物，需要將原代細(xì)胞分開至多個新的培養(yǎng)瓶中，這個過程叫傳代。（傳代后的細(xì)胞稱細(xì)胞系）。此期細(xì)胞增殖旺盛并維持二倍體核型。

9.無限細(xì)胞系：細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲得持久增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系，或連續(xù)細(xì)胞系。

10.傳代期，每代動物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的特點如何：

潛伏期：潛伏期為細(xì)胞從接種到貼壁培養(yǎng)生長繁殖的一段時間，有運動和代謝，但無分裂。

指數(shù)生長期：細(xì)胞隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行試驗研究。

平臺期：此期細(xì)胞已將其支持物表面占滿，細(xì)胞活力減弱，已不再進(jìn)行分裂增殖。

11.接觸抑制：細(xì)胞從接種到長滿底物表面后，由于細(xì)胞繁殖數(shù)量增多互相接觸后，不再增加的現(xiàn)象。

12.常用動物細(xì)胞簡寫及來源：

人：MRC-5、 WI-38、 Namalwa?

猴：Vero、 COS

鼠：BHK-21、 CHO-K1、 SP2/0-Ag14

狗：MDCK

昆蟲：Sf-9

13.灌流式培養(yǎng)優(yōu)缺點：

優(yōu)點：

①細(xì)胞可處在較穩(wěn)定的良好的環(huán)境中，有害代謝物濃度低；

②可極大地提高細(xì)胞密度，從而極大地提高了產(chǎn)品產(chǎn)量

③產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間縮短，可及時收留在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高；

④培養(yǎng)基的比消耗率較低，加之產(chǎn)量質(zhì)量的提高，生產(chǎn)成本明顯降低。

缺點：此方法最大困難是污染機(jī)率較高。?

14.動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)主要可分為懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和貼壁-懸浮培養(yǎng)，其中貼壁-懸浮培養(yǎng)又包括微載體培養(yǎng)、包埋和微囊培養(yǎng)以及結(jié)團(tuán)培養(yǎng)。

15.灌流式培養(yǎng)：當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時不斷地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。

16.簡述動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型。

攪拌釜式生物反應(yīng)器；

氣升式生物反應(yīng)器；

中空纖維式生物反應(yīng)器；

透析袋或膜式生物反應(yīng)器；

固定床或流化床生物反應(yīng)器

17.質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞后的篩選系統(tǒng)：二氫葉酸還原酶系統(tǒng)、谷氨酸合成酶系統(tǒng)。原理、區(qū)別？

18.什么是病毒載體？病毒載體的結(jié)構(gòu)組成（三質(zhì)粒包裝體系的載體結(jié)構(gòu)）以及侵染原理。如何利用病毒載體進(jìn)行免疫治療？

19.CRISPR-Cas9基因編輯的原理是？載體構(gòu)造如何？

第四章抗體制藥

1.單克隆抗體：針對一個抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體稱為單克隆抗體。

2.簡述雜交瘤細(xì)胞法制備單克隆抗體的步驟：（也要會詳細(xì)描述?。?/p>

1)用抗原免疫動物；

2)細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇；

3)篩選陽性克隆與克隆化；

4)雜交瘤細(xì)胞抗體性狀的鑒定；

5)單克隆抗體的大量制備與純化。

3.HAT培養(yǎng)基：單克隆抗體制備時用來篩選雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基，其中含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）。

4.HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞的原理

單克隆抗體是由鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的。在細(xì)胞融合后，為了將雜交瘤細(xì)胞與其他細(xì)胞（脾細(xì)胞、脾脾融合細(xì)胞、瘤細(xì)胞以及瘤瘤細(xì)胞）分開，可以使用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行陽性篩分。HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）。其中，A能阻斷內(nèi)源DNA合成途徑，瘤細(xì)胞和瘤瘤融合細(xì)胞因不能合成DNA而死亡。盡管脾細(xì)胞和脾脾融合細(xì)胞具有外源型DNA合成途徑，即利用H和T合成DNA，但是脾細(xì)胞和脾脾融合細(xì)胞不能在體外生存，而在幾天內(nèi)迅速死亡。雜交瘤細(xì)胞分別兼具了瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞的體外生存能力和外源型DNA合成能力而能夠在HAT培養(yǎng)基中順利增殖，從而達(dá)到篩選目的。

5.人-鼠嵌合抗體

將抗體中鼠源性的可變區(qū)保留下來，而將恒定區(qū)用人的進(jìn)行替換所形成的單克隆抗體就是人-鼠嵌合抗體。

6.改形抗體

將鼠源性單克隆抗體中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域，H和L鏈V區(qū)中的互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR），替換人Ig分子中的CDR序列所形成的抗體分子，被稱為改形抗體。

7.Fab抗體

用胃蛋白酶可將IgG的重鏈在鉸鏈區(qū)的C端處裂解，獲得兩個完全相同的可以結(jié)合抗原的蛋白質(zhì)片段，稱為抗原結(jié)合片段（fragment of antigen binding，F(xiàn)ab）稱為Fab抗體。

8.Fv抗體

由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的抗體稱作Fv抗體，天然Fv片段中VH和VL以非共價鍵結(jié)合。

9.svFc抗體

scFv抗體，即單鏈抗體，是由一段彈性連接肽把抗體可變區(qū)重鏈（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）相連而成，是具有親代抗體全部抗原結(jié)合特異性的最小功能結(jié)構(gòu)單位。

10.抗體診斷試劑包括：血清學(xué)鑒定用的抗體試劑、免疫標(biāo)記用的抗體試劑、導(dǎo)向診斷藥物和分化簇（CD）單克隆抗體系列等。

11.抗體治療藥物包括：放射性同位素標(biāo)記的抗體治療藥物、抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物和毒素偶聯(lián)的抗體藥物等。

12.詳細(xì)敘述噬菌體展示技術(shù)的原理與操作流程！

第五章植物細(xì)胞工程制藥

1.繪制植物表達(dá)載體的通用結(jié)構(gòu)示意圖

細(xì)致闡述農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化的原理和操作流程！

2.脫分化

已經(jīng)分化的細(xì)胞、組織和器官在人工培養(yǎng)的條件下又變成未分化的細(xì)胞和組織的過程。

3.再分化

通過脫分化誘導(dǎo)形成的愈傷組織在適宜的培養(yǎng)條件下成為胚狀體或直接分化出器官的過程。

4.外植體

用于植物細(xì)胞、組織培養(yǎng)的器官或組織，或器官與組織的切段。

5.次級代謝產(chǎn)物

次級代謝產(chǎn)物是指生物生長到一定階段后通過次級代謝合成的分子結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、并非是該生物生長和繁殖所必需的小分子物質(zhì)。

6.植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的組成

無機(jī)鹽；碳源；植物生長調(diào)節(jié)劑；；有機(jī)氮源；維生素。

7.兩步培養(yǎng)法

在生物發(fā)酵過程中，先使用適合細(xì)胞生長的培養(yǎng)基提高細(xì)胞密度，再換用適合生產(chǎn)用的培養(yǎng)基提高細(xì)胞生產(chǎn)能力的培養(yǎng)方法叫做兩步培養(yǎng)法。

8.誘導(dǎo)子

植物抗病生理過程中誘發(fā)植物產(chǎn)生植物抗毒素和引起植物自身防御反應(yīng)的因子，包括侵染植物的昆蟲、微生物上的分子以及植物細(xì)胞內(nèi)源性分子。

9.向培養(yǎng)基中加入固相或疏水液相形成的兩相培養(yǎng)法可減輕反饋抑制作用，并可保護(hù)產(chǎn)物免受培養(yǎng)基中催化酶或酸的影響。

10.生物轉(zhuǎn)化

也稱生物催化，是指利用生物離體培養(yǎng)細(xì)胞或器官及細(xì)胞器等對外源化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而獲得有價值產(chǎn)物的生物化學(xué)反應(yīng)。

第六章酶工程制藥

1.固定化酶

所謂固定化酶是指限制或固定于特定空間位置的酶，具體來說，是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。

2.固定化酶的特點：

固定化酶最大的特點是既具有生物催化劑的功能，又能具有固相催化劑的特性。具體優(yōu)缺點如下：

1)可以在較長時間內(nèi)多次使用，而且多數(shù)情況下，酶穩(wěn)定性提高；但是酶活力可能有損失。

2)酶與底物和產(chǎn)物易與分開；

3)反應(yīng)條件易與控制，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動控制；

4)酶的利用率高；

5)比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)，但不如完整菌體；

6)更適合小分子底物的催化，對大分子不適宜。

3.酶和細(xì)胞固定化的方法有：

載體結(jié)合法：物理吸附法、離子結(jié)合法和共價結(jié)合法；

交聯(lián)法：交聯(lián)酶法、酶-輔助蛋白交聯(lián)法、吸附交聯(lián)法和載體交聯(lián)法；

包埋法：網(wǎng)格型包埋和微囊型包埋；

熱處理法。

4.人工模擬酶

指根據(jù)酶的作用原理，用各種方法人為制造的具有酶性質(zhì)的催化劑，簡稱人工酶或模擬酶。

5.按照模擬酶的屬性可將其分為：主-客體酶、膠束酶、肽酶、半合成酶和分子印跡酶。

6.分子印跡

所謂分子印跡是指制備對某一特定化合物具有選擇性的聚合物的過程，這個特定化合物叫印跡分子或模板分子。

7.抗體酶

一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性，這種抗體叫做抗體酶。

第七章發(fā)酵工程技術(shù)概論

1.菌種選育包括自然選育、誘變選育、雜交選育等經(jīng)驗育種方法，還包括控制雜交育種、原生質(zhì)體融合、基因工程等定向育種方法。