細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是一個(gè)程序性細(xì)胞死亡的新形式，趁著邵峰院士在Nature上發(fā)表關(guān)于細(xì)胞焦亡的新機(jī)制文章的東風(fēng)，此方向又引發(fā)了一輪新的研究熱潮。近幾年細(xì)胞焦亡方向的pubmed發(fā)文量以及國自然中標(biāo)數(shù)量也是節(jié)節(jié)攀升，聯(lián)合鐵死亡成為了細(xì)胞死亡領(lǐng)域的一波新的研究風(fēng)向。

但是在鐵死亡的純生信文章數(shù)量迅速增加的形勢下，細(xì)胞焦亡的純生信分析類文章顯得有點(diǎn)過少了，在查閱了大量文獻(xiàn)后，我們發(fā)現(xiàn)其原因可能是細(xì)胞焦亡相關(guān)基因的獲得還是基于自己查閱文獻(xiàn)總結(jié)歸納篩選，沒有類似FerrDb的開源數(shù)據(jù)庫，但也正因如此，細(xì)胞焦亡的純生信文章仍然能利用常規(guī)的預(yù)后模型套路來發(fā)5+的文章，下面就讓我們一起來解析一下這篇文章的套路吧!

摘要

卵巢癌（OC）是一種高度惡性的婦科腫瘤，預(yù)后非常差。近年來已證明細(xì)胞焦亡是有炎癥發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡，但OC中焦亡相關(guān)基因的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性尚不清楚。因此，在本研究中作者鑒定到31個(gè)差異表達(dá)的焦亡調(diào)控因子，并根據(jù)這些DEGs將OC分為兩個(gè)亞型。利用TCGA隊(duì)列和LASSO Cox回歸方法構(gòu)建一個(gè)7-焦亡相關(guān)基因預(yù)后特征，將TCGA隊(duì)列分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，結(jié)果顯示低風(fēng)險(xiǎn)組OC患者生存率較高，并用GEO隊(duì)列進(jìn)行了驗(yàn)證。最后將風(fēng)險(xiǎn)評分作為獨(dú)立預(yù)后因素，并進(jìn)行了差異基因的功能分析，預(yù)示了焦亡相關(guān)基因在腫瘤免疫中的重要作用，可用于預(yù)測 OC 的預(yù)后。

數(shù)據(jù)來源

*??TCGA數(shù)據(jù)庫：379例OC患者的RNA-seq數(shù)據(jù)；

*??GTEx數(shù)據(jù)庫：88個(gè)正常卵巢組織的RNA-seq數(shù)據(jù)；

*??GEO數(shù)據(jù)庫： RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)作為額外的驗(yàn)證隊(duì)列。

焦亡相關(guān)基因的獲得

作者從之前的文獻(xiàn)綜述中提取了33個(gè)焦亡相關(guān)基因（焦亡通用靶標(biāo)基因），如下圖所示：

分析流程

結(jié)果

1. 鑒定正常組織和腫瘤組織之間的DEGs

在來自 88 個(gè)正常組織(GTEx)和 379 個(gè)腫瘤組織(TCGA)的數(shù)據(jù)中分析33個(gè)細(xì)胞焦亡相關(guān)的基因表達(dá)水平，最終作者確定了31個(gè)差異表達(dá)基因(DEG)，包括13個(gè)下調(diào)基因和18個(gè)上調(diào)基因（圖1A）。為了進(jìn)一步探索焦亡相關(guān)基因的相互作用，作者對33個(gè)焦亡相關(guān)基因進(jìn)行了PPI分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CASP1、PYCARD、NLRC4、NLRP1、CASP5、NLRP3、CASP8和AIM2是中樞基因，除CASP1基因外，其余基因均為DEGs（圖1B, C）。

2. 基于DEGs的腫瘤分型

為了探究31種細(xì)胞焦亡相關(guān)DEG的表達(dá)與OC亞型之間的聯(lián)系，作者對 TCGA 隊(duì)列中的所有379名OC患者進(jìn)行了一致聚類分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)聚類變量k ?= 2 時(shí)，組內(nèi)相關(guān)性最高，組間相關(guān)性較低，表明379名OC患者可以根據(jù)這31個(gè)DEGs分為兩類（圖2A）。聚類熱圖（圖2B）和生存分析（圖2C）表明兩個(gè)簇中的臨床特征和患者OS沒有明顯差異。

3. TCGA 隊(duì)列中構(gòu)建焦亡相關(guān)基因預(yù)后模型

對31個(gè)焦亡相關(guān)DEGs利用單變量Cox回歸分析進(jìn)行初步篩選，再利用LASSO回歸分析篩選得到7個(gè)焦亡相關(guān)基因（圖3A - C）。風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)計(jì)算如下：risk score =?(?0.187*AIM2 exp.) + (0.068*PLCG1 exp.) + (0.097*ELANE exp.) + (?0.143*PJVK exp.) + (?0.086*CASP3 exp.) + (?0.033*CASP6 exp.) + (0.130*GSDMA exp.)，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分公式計(jì)算的中位數(shù)，374 名患者被平均分為低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)亞組（圖3D）。主成分（PCA）分析顯示，兩個(gè)亞組可以完全區(qū)分開（圖3E），并且高風(fēng)險(xiǎn)組的患者生存時(shí)間較短且發(fā)生死亡的概率更高（圖3F），高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的OS具有顯著差異（圖3G）。最后通過ROC分析來評估預(yù)后模型的敏感性和特異性（圖3H）。

4. 預(yù)后模型的外部隊(duì)列驗(yàn)證

來自GEO數(shù)據(jù)庫 ( GSE140082 )的總共380名OC患者被用作驗(yàn)證隊(duì)列，根據(jù) TCGA 隊(duì)列中的中位風(fēng)險(xiǎn)評分將GEO驗(yàn)證隊(duì)列分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組（圖4A）。PCA分析顯示GEO隊(duì)列高、低風(fēng)險(xiǎn)亞組可以較好的分離（圖4B），且低風(fēng)險(xiǎn)組的生存率和死亡率較高（圖4C）。生存分析表明高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的生存率具有顯著差異（圖4D），最后通過ROC分析來證明該預(yù)測模型具有良好的預(yù)測功效（圖4E）。

5. 風(fēng)險(xiǎn)模型的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值

作者使用單變量和多變量 Cox 回歸分析來評估源自基因特征模型的風(fēng)險(xiǎn)評分是否可以作為獨(dú)立的預(yù)后因素。單變量 Cox 回歸分析表明，風(fēng)險(xiǎn)評分可作為預(yù)測 TCGA 和 GEO 隊(duì)列中生存率低的獨(dú)立因素，多因素Cox回歸分析表明，風(fēng)險(xiǎn)評分可以作為一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子（圖5A-5D）。此外，作者將 TCGA 隊(duì)列的臨床特征聚類為熱圖，發(fā)現(xiàn)患者的年齡和生存狀況在低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)亞組之間呈不同分布（圖5E）。

6. 基于風(fēng)險(xiǎn)模型的功能分析

為了進(jìn)一步探索高、低風(fēng)險(xiǎn)亞組之間基因功能和途徑的差異，作者利用“limma”R 包通過應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn) FDR < 0.05 和 |log 2 FC |來篩選 DEGs，總共確定了 115 個(gè) DEG，其中高危組有66個(gè)基因上調(diào)，其余49個(gè)基因下調(diào)。然后，基于這些 DEG 進(jìn)行GO富集分析和KEGG 通路分析，結(jié)果表明，DEGs主要與免疫反應(yīng)、趨化因子介導(dǎo)的信號通路和炎癥細(xì)胞趨化性相關(guān)（圖6A, B）。

7. 高、低風(fēng)險(xiǎn)亞組間免疫活性比較

在功能分析的基礎(chǔ)上，作者采用單樣本基因集富集分析（ssGSEA）進(jìn)一步比較了TCGA和GEO隊(duì)列中16種類型免疫細(xì)胞的富集評分和13種免疫相關(guān)通路的活性。結(jié)果表明，在 TCGA 隊(duì)列中高危亞組的免疫細(xì)胞浸潤水平普遍較低（圖7A），除 2 型 IFN 應(yīng)答通路外，其他 12 條免疫通路在高危組中的活性低于低危組（圖7B）。GEO隊(duì)列中的免疫活性情況與TCGA類似，此外，還發(fā)現(xiàn)低風(fēng)險(xiǎn)組中樹突狀細(xì)胞，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞富集程度較高，而2型IFN通路下調(diào)（圖7C和7D）。

結(jié)論

在這項(xiàng)研究中，作者首先研究了OC和正常組織中33個(gè)目前已知的細(xì)胞焦亡（焦亡通用靶標(biāo)基因，在其他癌種中也可以套用哦！）相關(guān)基因的 mRNA 水平，發(fā)現(xiàn)它們中的大多數(shù)是差異表達(dá)的。然而，基于 DEG 的聚類分析產(chǎn)生的兩個(gè)聚類在臨床特征上沒有顯示任何顯著差異。為了進(jìn)一步評估這些焦亡相關(guān)調(diào)節(jié)因子的預(yù)后價(jià)值，作者通過 Cox 單變量分析和 LASSO Cox 回歸分析構(gòu)建了一個(gè) 7 基因風(fēng)險(xiǎn)特征，然后在外部數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證其表現(xiàn)良好。功能分析表明，低危組和高危組之間的 DEGs 與免疫相關(guān)通路有關(guān)，并比較了低危組和高危組的免疫細(xì)胞浸潤和激活途徑。

結(jié)語

本文章的亮點(diǎn)在于作者前期篩選出了焦亡相關(guān)基因，利用常規(guī)的預(yù)后模型套路也能發(fā)到5分+文章。但此文章沒有涉及到風(fēng)險(xiǎn)模型中基因的驗(yàn)證，如果想文章再提升一個(gè)檔次的話可以考慮加入后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證部分。如果對細(xì)胞焦亡基因的預(yù)后模型構(gòu)建感興趣的話，我們更換疾病類型，重新查找相關(guān)數(shù)據(jù)，就可以實(shí)現(xiàn)文章的復(fù)現(xiàn)了。本次細(xì)胞焦亡的純生信分析文章分享和解析就到這里啦，大家一起學(xué)習(xí)起來吧!

參考文獻(xiàn)

Ye, Ying et al. “A novel defined pyroptosis-related gene signature for predicting the prognosis of ovarian cancer.” Cell death discovery vol. 7,1 71. 7 Apr. 2021, doi:10.1038/s41420-021-00451-x