定性、定量、定位，WB、ELISA、IHC 三大免疫學實驗，這一篇全搞定！

2023-11-24 17:07 作者:科研根號三 0人讀過 | 我要投稿

免疫學檢測是應用免疫學理論設計的一系列測定抗原、抗體、免疫細胞及其分泌的細胞因子的實驗手段，用途非常廣泛，既可用于基礎理論和應用研究，因此免疫學研究一直都是生命科學領域學術前沿，發(fā)表的文章也幾乎都是Cell、Natrue、Science及其子刊寵兒。

免疫印跡（WB）、免疫組化（IHC）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），是免疫學三大常用工具，應用于目的蛋白的定位、定性和定量。

有了這篇純干貨，相信大家就能輕松搞定免疫學三巨頭實驗的各種疑難雜癥！

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一、免疫印跡WB（Western blot）-偏向于定性和半定量

WB，是Western blotting的縮寫，即蛋白質印跡法，又稱免疫印跡（immunoblotting）,也就通過電泳技術分離不同組分，再采用印跡技術將蛋白質轉移（“印”）到特定的膜上，再利用抗原-抗體的特異性結合原理，用抗體作為探針去實現(xiàn)檢測復雜樣品中的靶標蛋白的方法，這項技術也可以用來檢測不同時期蛋白表達的水平以及蛋白相互作用等方面。

其基本原理是：通過電泳區(qū)分不同組分，并轉移至固相支持物，通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質進行檢測，蛋白質的WESTERN 印跡技術結合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點，可檢測到低至1~5ng（最低可到10~100pg）中等大小的靶蛋白。

實驗流程

先要進行 SDS-PAGE，然后將分離開的蛋白質樣品用電轉儀轉移到固相載體上，而后利用抗原-抗體-標記物顯色來檢測樣品，可以用于定性和半定量。

常見問題

1.高背景

2.信號弱或無信號

3.非特異性條帶

4.彌散型條帶

12個高頻異常結果（帶圖分析）

1.無背景無條帶

上圖展示一點信號都沒有，大部分情況是因為抗體加錯了。如果中間出現(xiàn)細微的條帶，可能是蛋白上樣量太少，一抗?jié)舛冗^低，ECL 發(fā)光液失效。

2.高背景

高背景是 WB 實驗中最常見的問題，目的條帶單一清晰，但其他地方又彌漫性較均一的背景（比較連續(xù)的）。雜帶多大概率是抗體特異性不好，也有可能抗體濃度太高，可嘗試降低一抗?jié)舛冗M行實驗。

3.非特異性條帶

此種情況絕大多數(shù)是因為一抗不好，你無法判斷哪一條是目的條帶。如果實在沒有更好的抗體，建議采用陰性對照和陽性對照來確定上述哪個條帶是目的條帶。當然也有一種很小幾率的可能是一抗?jié)舛忍咭鸬姆翘禺愋越Y合。

4.條帶中出現(xiàn)邊緣規(guī)則的白圈

我們常常將電轉液倒入一個盤子里，倒入的液體不宜太多或太少，建議高度與放上第一層濾紙齊平，然后往濾紙上澆點轉膜液，往膠上面澆點電轉液，用兩只手的拇指和食指輕輕夾住 NC 膜的兩側中間，使膜成 U 型，然后將 U 型底部接觸膠的中間，慢慢往兩邊放下膜，這樣一般氣泡很少。然后上層濾紙同樣用 U 型的放置方法，用玻璃棒稍微貼實下，最后蓋上海綿。

5.出現(xiàn)黑點和黑斑

牛奶溶解后，最好靜止一下，然后輕輕吸取上層牛奶進行封閉，封閉結束后一定要洗 3 遍之后再加一抗。

6.條帶拖尾

這種情況一般出現(xiàn)在大分子量抗體實驗中，是因為一抗?jié)舛忍撸饔脮r間太長引起的。另外洗一抗和洗二抗千萬不要偷工減漏，建議 5min*5 次，不要擔心洗這么多次把抗體和蛋白洗掉了，真正的抗原抗體相結合通過這種方式是洗不掉的。

7.出現(xiàn)非均一性背景

封閉時洗一抗洗二抗，以及發(fā)光時都應時刻注意切記蛋白面風干，一旦風干很可能會導致這個結果。

8.某個條帶變形

很多實驗室中使用的不是最新設備，比如配膠用的海綿墊，如果用了很多年，會從下面往上面漏小氣泡，當氣泡足夠小并且膠快凝固的時候，走到中間的小氣泡就停留在膠內，并會影響到后面的跑膠。另外配膠用的水，SDS，Tris 緩沖液要注意不要有雜質。

9.條帶不均一

出現(xiàn)啞鈴最大的可能是膠沒有配好，膠凝固后不均一。如果你拔完梳子后出現(xiàn)上圖中下面部分的情況，多半會出現(xiàn)啞鈴狀。另外還有一種可能是樣品中含有太多雜質，沒有離心下來，然后雜質沉積在孔的中間，蛋白自然被推擠到兩邊。

10.最邊緣條帶彎曲

一般我們使用的是 10 孔的膠，如果你上樣剛好 10 個孔，那么最兩頭的兩個孔肯定會歪曲。另外上樣最好在膠的中間，這樣電場均一

11.條帶笑臉，marker正常

準備樣本主要確認上樣緩沖液是否為近期配置，并且要妥善保存，否則就會浪費珍貴的實驗樣本。一般電泳過程中恒壓電泳，濃縮膠 80V，分離膠 120V，整個過程差不多需 2 個小時左右。

12.曝光結果條帶扭曲

對于大分子量的抗體，跑膠前可以先把樣本煮一下，然后稍微離心一下，同樣也可以改善這種情況。

二、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）--可以定性也可以定量

用到了免疫學原理和化學反應顯色，需要將抗原或抗體結合到固相載體表面，從而使后來形成的抗原-抗體-酶-底物復合物粘附在載體上，這就是「吸附」的含義。

目前常用的ELISA方法有直接法、間接法、雙抗夾心法、競爭法ELISA。

在測定蛋白質等大分子時常用雙抗夾心ELISA方法，在敏感性基因特異性上有明顯的優(yōu)勢。

實驗流程

注意事項

1. 樣本收集

每個標本量收集體積＝100 μL×檢測種類，如要做復孔，標本量收集體積＝100 μL×檢測種類×2。對收集后當天進行檢測的標本，儲存在 4 ℃ 備用，如有特殊原因需要周期收集標本，將標本及時分裝后放在 -20 ℃ 或 -70 ℃ 條件下保存，避免反復凍融。標本 2~8 ℃ 可保存 48 小時，-20 ℃ 可保存1個月。-70 ℃ 可保存 6 個月。部分激素類標本需添加抑肽酶。如需離心的樣本，離心轉速不宜過高（2,000-3,000）

2. 樣品、標準品、質控品稀釋

加完樣本稀釋液溶解標準品后應混勻放置室溫 10~15 min 后再開始梯度稀釋標準品

3. 樣品捕獲抗體孵育

37 ℃ 恒溫孵育，避免溫度變化過大

4. 生物素標記的抗體加入及孵育

生物素標記的抗體需用抗體稀釋液按 1:100 配制，在加入 96 孔板前 2 小時內準備，37 ℃ 恒溫孵育，避免溫度變化過大

5. 洗滌

機洗：將 25X 洗滌緩沖液稀釋成 1X，1X 洗滌緩沖液洗三次，每次加 300 μL 浸泡 60 s 手洗：手洗次數(shù)應比機洗次數(shù)多，浸泡時間也應適當延長*手洗容易導致吸附在酶標板底部的試劑脫落，從而導致結果偏小，手洗次數(shù)過多也會影響實驗結果，建議機洗

6. 親和素過氧化物酶（ABC）加入及孵育

ABC 在加入酶標板前 1 個小時內用 ABC 稀釋液按 1:100 配制，使用前應放至室溫平衡 30 min

7. 底物顯色（TMB 顯色）孵育

TMB 在使用前應放置室溫平衡 30 min，加的量為 90 μL

8. 終止液終止反應

加完 TMB 終止液應讓其混勻再在酶標儀上讀數(shù)

9. 酶標儀讀數(shù)

在 450 nm 波長處測定 O.D 值

10. 根據(jù) O.D 值計算樣本濃度

使用 CurveExpert 軟件擬合標準曲線，根據(jù)標準曲線的擬合度（r 或 R2）以及殘差平方和（s）選擇合適的曲線

常見問題

1.ELISA 試劑盒可以檢測哪些類型的標本？

我們的大多數(shù) ELISA 試劑盒均適用于血清，血漿，細胞培養(yǎng)上清液和其它體液。在產品說明書和我們的目錄上您會看到具體的適用范圍。

2.樣本為什么需要稀釋？

1）在一些測試中，樣本的讀數(shù)高于標準曲線，為了得到更加準確的結果，需使分析物的含量在測定范圍內，因此需要稀釋；2）以降低非特異性反應，使特異性的抗原抗體反應充分體現(xiàn)出來。

3.背景色過高主要有哪些原因？

4.梯度稀釋時出現(xiàn)跳孔現(xiàn)象主要有哪些原因？

ELISA 試劑盒常見問題解析

三、免疫組化（IHC）--偏向于定位

融合了免疫學原理 (抗原抗體特異性結合) 和組織學技術 (組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等)，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色，來對組織 (細胞) 內抗原進行定位、定性及定量的研究 (主要是定位)。

實驗流程

注意事項

1.組織取材

為避免蛋白丟失及組織受損引起的非特異試劑吸附，取材須快速（組織塊也不宜太大）且要盡量避免人為損傷。

2.固定

固定要及時、徹底，但也不能固定過久。實驗證明甲醛固定時間越久的組織越容易出現(xiàn)自發(fā)熒光及非特異性染色。一般以 12~36 小時最好。

3.石蠟片與冰凍片的選擇

石蠟片制作對設備要求較冰凍片低，組織結構更好，保存條件簡單時間也久。但對部分蛋白有較強烈的破壞作用，對蛋白保護較冰凍片差。冰凍片對蛋白的保護較石蠟片好，制作起來也較快。

4.滅活

過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)的一定要做內源性過氧化物酶的滅活，而對于堿性磷酸酶（AP）系統(tǒng)和免疫熒光這個步驟不需要做。

5.抗原修復

不同的樣本、不同的蛋白其最佳的抗原修復方式會有所區(qū)別，熱修復（酸性修復液（檸檬酸鹽修復液）、堿性修復液（EDTA 修復液））及酶修復（蛋白酶）都可做嘗試。對于陳舊的樣本要增加修復強度，比如延長修復時間。

6.封閉

常用的封閉液有 5% BSA 和血清。BSA 是通用型的封閉液。血清應選擇與二抗同源的血清。

7.抗體孵育

一抗一定要與實驗及樣本匹配的，孵育條件以 4 ℃ 過夜最佳。二抗應匹配一抗， 37 ℃ 孵育半小時即可。

8.顯色

DAB 顯色建議在鏡下控制反應時間，在陽性及背景之間選擇平衡點。

9.結果觀察

建議在數(shù)據(jù)庫中查詢準確的表達部位，比如

https://www.uniprot.org/

https://www.proteinatlas.org/

常見問題

1.無染色

2.高背景

3.非特異性染色

13個高頻異常結果（帶圖分析）

1、標本的固定

常見問題：

組織固定不及時或不完全固定，HE染色細胞核發(fā)灰模糊，對比不鮮明；免疫組化染色結果不理想，通常組織離體2h后抗原完全丟失。

案例示范1

案例示范2

解決建議：

① 組織離體后盡快固定，組織塊大小為15×15×5mm，切開固定效果好；

② 固定液以10％中性福爾馬林緩沖液為佳；

③ 固定時間在4h-48h之間，長時間固定會影響抗原決定簇的暴露，產生陰性結果；

④ 固定液的量要超過組織體積5倍以上。

2、標本的取材，脫水，浸蠟

常見問題：

如果組織脫水、浸蠟不充分，蠟塊會出現(xiàn)組織收縮凹陷，而且在免疫組化熱抗原修復操作時會容易脫片。

解決建議：

① 梯度酒精脫水盡量徹底充分；

② 二甲苯透明時間不宜長，1～3h為佳，透明過度會導致組織發(fā)硬發(fā)脆；

③ 浸蠟應選擇低熔點的石蠟，浸蠟應充分。

3、標本的切片，撈片，烤片

常見問題：

切片太厚，有刀痕，有褶皺，脫片。

案例示范1

案例示范2

解決建議：

① 切片厚度視組織而定，如同淋巴結、腎等需要比較薄（不超過3um），腦組織需要較厚（尤其是取新鮮標本冰凍制片時），常規(guī)都要6-8um最佳，冰凍可切至10um；其他一般如胃腸道、肝膽等等組織，2-4um均可,太厚易掉片，細胞重疊，影響觀察。切片角度和刀片新舊程度對切片效果的影響較大，切片角度視切片機型號而異；新刀片容易切出完好的切片。

② 撈片要求達到無皺折、無氣泡，水溫宜在40℃左右。

③ 粘片時需準備蛋白甘油，蛋白甘油由雞蛋蛋清和甘油調配而成，比例為1：1。?先將一滴蛋白甘油涂抹在干凈的載玻片上，然后用載玻片從水中將展好的蠟片撈起，平放入烘箱內進行烘干?；蛘卟Ｆ梅烂撈蚨嗑圪嚢彼崽幚?，以增強粘附性。

④ 烘干溫度為50℃，時間為12～24h。

4.標本的脫蠟不完全

常見問題：

脫蠟不全,組織出現(xiàn)異染現(xiàn)象,異染現(xiàn)象一般是蘇木素著色不佳,HE染色沒有選擇性,染色不均勻。有的是伊紅染不上。

解決建議：

根據(jù)不同的室溫，調節(jié)脫蠟的時間，原則上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟。

5.抗原修復

抗原修復是免疫組化中不可忽略的關鍵步驟。原因是組織經福爾馬林等固定液固定和石蠟包埋后，抗原決定簇與核酸易發(fā)生交聯(lián)，引起蛋白質空間結構的改變，導致抗原決定簇被封閉，是抗原與抗體結合點減少，從而令抗原抗原的陽性檢測率及著色強度相對減弱。這種交聯(lián)在高溫加熱或是蛋白酶水解作用下會發(fā)生可逆反應，恢復蛋白的原有構象，這一過程就是抗原修復。

常見問題：

陽性檢測率及著色強度相對減弱。

案例示范

經驗分享：

① 抗原修復緩沖液有多種，常用的則為檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），EDTA緩沖液（pH8.0-9.0），Tris/Tris-EDTA緩沖液（pH9.0-10.0），或者胰酶法（pH3.5±0.2）；

② 修復液的不同PH值對染色結果的影響比較大；

③ 沒有一種抗原修復緩沖液可以適用于所有抗原；

④ 大部分抗原在修復液pH8.0-9.0的范圍值可以獲得一個普遍較好的修復效果，所以堿性緩沖液應用普遍些。

6.封閉

常見問題：

① 封閉時間過長，會導致陽性信號減弱甚至出現(xiàn)假陰性。

② 封閉時間不足，會導致背景增強甚至出現(xiàn)假陽性。

案例示范：

解決建議：

① 根據(jù)實驗實際情況選擇合適的封閉試劑和封閉時間。

② 根據(jù)二抗系統(tǒng)中是否含有生物素而選擇封閉劑。

③ 無生物素的二抗系統(tǒng)可以不使用封閉劑，如Immunoway的RS0011通用型二抗。

④ 卵白素類的二抗系統(tǒng)需要根據(jù)生物素的種類選擇相應的封閉劑在一抗前處理組織切片。

⑤ 封閉血清一般是和二抗同一來源，可封閉非特異性結合位點，降低背景噪音。也可使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗的來源一致。

7、洗滌

案例示范

解決建議：

進行充分洗滌。

8.干片

案例示范

解決建議：

加入Tween-20的緩沖液能夠更好地防止切片干燥。

9.邊緣效應

案例示范

解決建議：

組織切片與玻片黏貼牢固，試劑完全覆蓋組織防止干片，加入Tween-20的緩沖液能夠更好地防止邊緣效應。

10.一抗的選擇

免疫組化耗時長，步驟繁多，為了得到特異性染色，獲得可靠結論，選擇合適的一抗十分關鍵。基本原則是選擇選擇特異性強，靈敏度高，背景低的抗體，結果穩(wěn)定、重復再現(xiàn)性良好的抗體。

①抗體特異性
常見問題：
抗體特異性差，定位不準確。
案例示范1

解決建議：
抗體的特異性是選擇抗體最重要的原則，不同抗體特異性不同，組織特異性，細胞特異性，細胞亞定位的特異性需都準確。

②抗體的染色強度
常見問題：
檢測結果會出現(xiàn)弱陽性。

解決建議：
適當調整抗體稀釋比，或者選擇染色強度高，高親和力的抗體。

③抗體稀釋比的影響
常見問題：
染色結果出現(xiàn)非特異性染色或者是低背景。
案例示范

解決建議：
當結果出現(xiàn)非特異性染色或者有背景時，可以適當調整一抗的稀釋比例進行改善，特異性強的抗體檢測結果不易受稀釋比例的影響。

④一抗孵育條件

常見問題：

孵育條件對染色結果有影響。

案例示范

解決建議：

孵育條件對染色結果略有影響，需篩選合適的孵育條件。

11.不同組織的影響

常見問題

染色結果與預期不符，檢測陰性或者弱陽性。

案例示范

解決建議

設置陽性組織切片的對照，因為同一蛋白在不同組織中的表達會有很大的差異。

12.二抗的選擇

常見問題

使用不同的二抗顯色系統(tǒng)會出現(xiàn)不同的結果，可能會有弱陽性結果。

案例示范

解決建議：

使用多聚物酶標記二抗比普通的HRP直標二抗靈敏度更高，背景更干凈，對比更明顯。

13.DAB顯色

1）DAB絮狀或團狀沉積

常見問題

產生深棕至黑色的DAB絮狀或團狀沉積于組織切片上。

案例示范

解決建議：

① 現(xiàn)配現(xiàn)用：因為DAB顯色液配置好了之后極容易產生DAB的沉積，從而導致樣本上會出現(xiàn)深棕色的絮狀沉淀，干擾結果的判定。

② 顯色時間：所有說明書上的顯色時間均為一個范圍，有的反應迅速的30s-3min，有的反應緩慢的3-20min，應該靈活調整，最好是滴加了DAB顯色液后置于顯微鏡下控制顯色時間。

③ 顯示時間技巧：可選擇一張陽性的片子，用計時器精確計時在顯微鏡下判斷出具體時間后，再對所有片子進行顯色，采用相同的時間來界定。一般如果抗體濃度適宜，操作無誤，10分鐘內肯定能夠顯色，如果超過該時間，說明一抗比例不夠或者封閉太久等等原因。顯色時間越短，則說明抗體濃度高或抗體孵育時間過長，需下調抗體濃度或縮短抗體孵育時間。

2）信號偏弱

常見問題

信號偏弱。

案例示范

解決建議：

適當延長顯色時間，滴加了DAB顯色液后置于顯微鏡下控制顯色時間。

蘇木素使用原則

① 不同的蘇木素配方的染色時間各有不同，配置的新舊程度染色時間也不同。

② 國際上常用的為Harris蘇木素，因為配方中含汞，通常還需要進行分化，返藍的步驟，但顏色亮麗。

③ 改良的Mayer蘇木素配方不需要分化，時間可以根據(jù)配置的時間調整染色時間15s-2min。

免疫組化的結果分析

①對照組必設。如陰性、陽性及自身對照。

從以下表中可知，只有6、7實驗結果有意義。

1-5均因對照組的結果已否定抗體的特異性或因ICH技術操作存在錯誤等而使實驗結果失去意義，則必須重復實驗或換用抗體。

②陽性著色細胞計數(shù)法。在 40 倍光鏡下，隨機選擇不重疊的 10 個視野，人工或機器計數(shù)陽性著色細胞，每組 3-6 張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。

③灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用 image j 進行灰密度分析，然后進行統(tǒng)計分析即可。

④分級法。免疫組化的半定量一般分為三級：弱（+），中（++），強（+++）。以綠色免疫熒光為例，則表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱（+）=1，中（++）=2，強（+++）=3。至少隨機觀察5-10個HPF。然后根據(jù)（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3計算出數(shù)值；總數(shù)值<1.0者為（+），1.0-1.5者為(++), >1.5者為(+++)。