血管系統(tǒng)是人體內(nèi)的一大循環(huán)系統(tǒng)，按廣義可分為心臟和全身的血管系統(tǒng)，按部位又可分為心血管（心臟周圍的供血系統(tǒng)）、腦血管（腦部供血系統(tǒng)）和外周血管（軀干、四肢和內(nèi)臟的血管），它們共同維持著機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、新陳代謝和各組織器官的正常生理機能。

動脈和靜脈的管壁主要是由血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞等組成（圖1左）[1]，毛細血管則主要是單層的內(nèi)皮細胞和基膜組成，血管壁細胞在調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)中起著非常重要的作用。另外，血腦屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的微血管系統(tǒng)，由內(nèi)皮細胞和周細胞組成（圖1右）[2]，是血液與大腦進行物質(zhì)交換、保護神經(jīng)組織免受毒素和病原體侵害至關重要的屏障。更重要的是，內(nèi)皮功能障礙或中膜血管平滑肌受損都會導致一系列心血管疾病的發(fā)生，例如動脈粥樣硬化、主動脈瘤、腦卒中、高血壓等等。目前大部分心血管疾病都沒有很好的治療策略，主要以預防和外科手術介入為主，因此研究人員都在積極尋找有效的藥物治療靶點。與此同時，基因治療的興起和迅速發(fā)展為心血管疾病的治療拓寬了道路。在往期《AAV在心血管疾病研究中的靶向策略》中通過心臟疾病的研究，已經(jīng)為大家介紹了腺相關病毒在靶向心臟中的應用，接下來我們再來看下其在體內(nèi)靶向感染血管的策略吧。

圖1 血管解剖結(jié)構[1, 2]。上：動、靜脈主要結(jié)構；下：中樞神經(jīng)系統(tǒng)微血管結(jié)構（EC：內(nèi)皮細胞；PC：周細胞；BM：基底膜；AE：星形膠質(zhì)細胞末端）

腺相關病毒載體（adeno-associated virus，AAV）具有安全性好、宿主范圍廣、免疫源性低、以及長期轉(zhuǎn)基因表達能力等優(yōu)點，已成為一種有吸引力的基因治療工具。AAV可以通過攜帶不同的血清型和組織/細胞特異性啟動子去感染相應的組織或細胞，那么目前有哪些血清型和啟動子可以靶向心血管呢？除此之外，對于腦血管和外周血管的感染可不可以做到呢？下面將為您一一介紹。

一、血清型選擇

AAV血清型是由Cap基因編碼的衣殼蛋白決定的，通過識別細胞表面受體來靶向不同的組織器官，從而達到感染特定組織的目的。目前已有研究報道，AAV1、AAV5和AAV9血清型均可感染主動脈（圖2，3）[3,4]。

圖2 AAV1、AAV2、AAV5感染大鼠主動脈效率比較[3]

圖3 AAV9感染小鼠頸動脈[4]

事實上，AAV1、5、9在體內(nèi)感染的組織具有一定的廣泛性。漢恒生物可提供更具靶向性的AAV血清型：AAV-Vec、AAV-eVEC、AAV-BR1和AAV-BI30（表1）。

表1 特異性感染內(nèi)皮細胞的AAV血清型

（1）AAV-Vec高效感染血管內(nèi)皮細胞[5]

Vec血清型是在AAV2血清型的基礎上改造而來的，它可以與內(nèi)皮細胞表面的肝素/HSPG結(jié)合，盡管與AAV2的結(jié)合能力相似，但AAV-Vec的細胞內(nèi)化率更高。據(jù)文獻報道，作者將AAV2、AAV-Nec（先前報道過靶向內(nèi)皮細胞的血清型）、AAV-Vec分別感染人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs），在不同GOI（載體基因組與細胞的比）下，AAV-Vec的感染效率都是最高且具有統(tǒng)計學意義的（圖4）[5]。因此，提示AAV-Vec更適合用于體內(nèi)外轉(zhuǎn)導血管內(nèi)皮細胞。

圖4 與AAV2相比，AAV-Nec、AAV-Vec轉(zhuǎn)導HUVECs的效率

（2）AAV-BR1高效感染腦微血管內(nèi)皮細胞

BR1血清型也是通過在AAV2血清型中插入相應多肽篩選出來的，具有非常好的腦血管內(nèi)皮特異性。據(jù)文獻報道[6]，作者將野生型AAV2、AAV-PPS（先前報道過的腦靶向血清型）、AAV-BR1通過尾靜脈注射感染小鼠，2周后經(jīng)活體成像顯示，與AAV2和AAV-PPS相比，AAV-BR1僅在大腦中聚集（圖5 左）；隨后來自小腦、嗅球、紋狀體和大腦皮層的免疫熒光結(jié)果顯示，AAV-BR1所攜帶的eGFP與內(nèi)皮細胞標志物CD31在這些部位中共定位（圖5 右），表明AAV-BR1能高效感染腦血管內(nèi)皮細胞。

圖5 上：AAV-BR1經(jīng)尾靜脈注射靶向感染大腦；

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?下：AAV-BRA1感染腦內(nèi)皮細胞

（3）AAV-BI30高效感染腦血管內(nèi)皮細胞

AAV-BR1更傾向于感染腦微血管內(nèi)皮細胞，即毛細血管內(nèi)皮細胞，對于動脈和靜脈內(nèi)皮的感染效率相對不足。為了解決這一問題，科研人員在AAV9血清型的基礎上進行改造，并命名為AAV-BI30血清型。經(jīng)實驗驗證，AAV-BI30能夠有效感染腦部動脈、靜脈和毛細血管的內(nèi)皮，而AAV-BR1主要局限于毛細血管內(nèi)皮（圖6）[7]。因此，相比于AAV-BR1，AAV-BI30感染腦血管內(nèi)皮細胞的效率更高、用途更廣；除大腦外，對整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜血管的內(nèi)皮細胞也有很好的嗜性[7]。

圖6 AAV-BI30有效轉(zhuǎn)導大腦動、靜脈內(nèi)皮細胞

二、?組織（細胞）特異性啟動子

表2 漢恒生物提供靶向血管細胞的特異性啟動子

（1）TIE1內(nèi)皮細胞特異性啟動子

?????? TIE1是一種受體酪氨酸激酶，在血管內(nèi)皮細胞中特異性表達，因此TIE1啟動子可以作為靶向血管內(nèi)皮細胞的特異性啟動子。有文獻報道，將AAV-CMV-eGFP和AAV-TIE-eGFP通過頸動脈結(jié)扎法注射到家兔動脈腔中，3周后的冰凍切片結(jié)果顯示，TIE啟動子使eGFP在頸動脈內(nèi)皮細胞中高表達（圖7）[8]，證實了TIE啟動子的血管內(nèi)皮細胞特異性。

圖7 AAV-TIE-eGFP高效感染血管內(nèi)皮細胞

如圖8所示[9]，是漢恒生物客戶發(fā)表在《Antioxidants》雜志上題為“Hydroxysafflor Yellow A Blocks HIF-1α Induction of NOX2 and Protects ZO-1 Protein in Cerebral Microvascular Endothelium”的文章，作者將漢恒生物提供的AAV2/BR1-TIE-miR30-m-Tjp1經(jīng)小鼠尾靜脈注射，成功感染腦微血管內(nèi)皮細胞，并實現(xiàn)對目的基因ZO-1的敲低。

圖8 AAV2/BR1-TIE-miR30-m-Tjp1感染小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞

并敲低ZO-1

（2）SM22α平滑肌細胞特異性啟動子

?????? SM22α是一種22 kDa的鈣調(diào)相關蛋白，在平滑肌中特異性表達，且為平滑肌細胞最為廣泛的標志物。因此，AAV攜帶SM22α啟動子可用于靶向感染平滑肌細胞。然而，平滑肌不僅分布在血管，在消化道、呼吸道和生殖系統(tǒng)等也有廣泛的分布，所以SM22α啟動子通常需要配合相應的AAV血清型來靶向血管平滑肌細胞。如圖9所示[10]，是漢恒生物客戶發(fā)表在《Cell Death & Differentiation》雜志題為“Ferroptotic stress facilitates smooth muscle cell dedifferentiation in arterial remodelling by disrupting mitochondrial homeostasis”的文章，作者通過漢恒生物構建了AAV2/9-SM22α-mGPX4-Flag-ZsGreen和AAV2/9-SM22α-ZsGreen，將病毒經(jīng)小鼠頸總動脈原位注射至血管腔中，2周后再進行尾靜脈注射，成功在小鼠頸動脈血管平滑肌細胞中過表達GPX4。

圖9 AAV2/9-SM22α-mGPX4-Flag-ZsGreen感染

小鼠頸動脈血管平滑肌細胞并過表達GPX4

三、注射方式和劑量

向血管遞送AAV的方式主要有系統(tǒng)性注射（尾靜脈注射）、原位注射（結(jié)扎法和凝膠孵育），對于腦血管感染還可以采用腦立體定位注射（表3）。

表3 血管遞送AAV的方式

心血管系統(tǒng)的血管部分就介紹到此，大家可以查閱往期內(nèi)容《AAV在心血管疾病研究中的靶向策略》，進一步了解AAV在心臟中的應用策略吧。后續(xù)我們將會給大家?guī)砀囿w內(nèi)不同組織/細胞特異性調(diào)控的干貨，敬請關注。

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