木質(zhì)纖維素生物質(zhì)主要由纖維素，半纖維素和木質(zhì)素組成，是地球上最豐富，可再生的能源。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的降解和自然界中碳循環(huán)的持續(xù)主要通過微生物作用來維持，包括不同的真菌物種，如木霉，曲霉和青霉菌。微生物在自然界中起著重要作用。這些生物產(chǎn)生的降解生物質(zhì)的酶也可用于食品，飼料，造紙和紡織工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域。里氏木霉（Trichoderma reesei）是一種真菌，是纖維素酶和半纖維素酶的知名高效生產(chǎn)商，因此被酶工業(yè)廣泛用于生產(chǎn)其自身的內(nèi)源酶以及生產(chǎn)異質(zhì)蛋白。兩年來，許多研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種強(qiáng)大的基因組編輯方法，基因敲除可促進(jìn)多種生物體中基因組的遺傳改變。到目前為止，還沒有關(guān)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)或其他系統(tǒng)的報(bào)道。

盡管該技術(shù)已成功應(yīng)用于酵母中，但絲狀真菌，甚至是模型生物Neurospora crassa中的基因組編輯方法也是如此。

里氏木霉（Teelemorph Hypocrea jecorina）是一種嗜溫軟腐子囊真菌，在工業(yè)上被廣泛用作纖維素酶和半纖維素酶的來源，用于水解植物細(xì)胞壁多糖。來自農(nóng)作物殘余物，草，木材和城市固體廢物的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)代表了豐富的可再生資源，作為未來的生物燃料來源，這一資源變得越來越重要。微生物是地球上對環(huán)境無害的肝臟。盡管用纖維素乙醇代替汽油可以顯著減少大氣中的溫室氣體并減少全球變暖，但將生物質(zhì)多糖水解為可發(fā)酵糖的高成本仍然是必須有效克服的主要障礙，才能使纖維素乙醇有效地商業(yè)化。由于纖維素酶和半纖維素酶的成本大大影響了生物乙醇的價(jià)格，因此需要這些酶的廉價(jià)得多的來源。因此，基因工程技術(shù)，基因敲除方案和DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)改善了產(chǎn)工業(yè)酶的里氏木霉菌株。

使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在里氏木霉中進(jìn)行有效的基因組編輯

?研究人員通過特異性密碼子優(yōu)化和體外RNA轉(zhuǎn)錄證明了在絲狀真菌里氏木霉中建立CRISPR/Cas9系統(tǒng)。結(jié)果表明，通過誘導(dǎo)Cas9表達(dá)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是可控的和有條件的。該系統(tǒng)通過有效的同源重組，甚至使用短的同源臂，在靶基因中產(chǎn)生了位點(diǎn)特異性突變。該系統(tǒng)還提供了同時(shí)靶向多個(gè)基因的適用且有希望的方法。我們的結(jié)果表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是里氏木霉和其他絲狀真菌物種最有力的基因組操縱工具，這可能會加速這些絲狀真菌的功能基因組學(xué)和菌株改良研究。

使用體外組裝的Cas9/gRNA復(fù)合體在里氏木霉中快速破壞基因

在這項(xiàng)研究中，研究人員使用CRISPR / Cas9在里氏木霉菌中測試了兩種基因破壞方法。細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Cas9導(dǎo)致里氏木霉QM9414出現(xiàn)意外脫靶基因破壞，有利于在目標(biāo)ura5下游70和100 bp處插入9或12 bp。因此，通過在體外組裝Cas9和gRNA，然后將核糖核蛋白復(fù)合物與含有pyr4標(biāo)記基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為里氏木霉TU-6，建立了另一種方法。當(dāng)使用靶向cbh1的gRNA時(shí)，發(fā)現(xiàn)27個(gè)轉(zhuǎn)化子中有8個(gè)失去表達(dá)CBH1的能力，這表明通過基因組編輯成功破壞了cbh1。將包含共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，染色體基因或這些核苷酸混合物的大DNA片段插入到破壞的cbh1基因座中.Cas9 / gRNA復(fù)合物直接轉(zhuǎn)化入細(xì)胞是破壞里氏木霉基因的快速方法并可能在菌株改良和功能基因組學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。

銅控制的RNA干擾系統(tǒng)，用于里氏木霉中靶基因的可逆沉默

研究人員將銅響應(yīng)性tcu1啟動(dòng)子整合到RNAi介導(dǎo)的沉默系統(tǒng)中，以開發(fā)一種可控制的RNAi介導(dǎo)的沉默系統(tǒng)，即一種里氏木霉。作為概念的證明，當(dāng)各自的RNAi片段被敲除時(shí)，在無銅的情況下，成功地敲除了原養(yǎng)型pyr4基因，由Avicel誘導(dǎo)的高表達(dá)cel7a和xyr1基因以及敲除被證明難以治療的fab1基因表達(dá)。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細(xì)胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。

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