WB是研究蛋白表達的一個經(jīng)典方法。對于一些時間點或者是不同組織蛋白表達量的分析就涉及到量的變化。一個比較簡單的綜合性質(zhì)圖像處理軟件Image J可以很方便的進行灰度分析。
對于一些時間點或者是不同組織蛋白表達量的分析就涉及到量的變化。通過觀察處理前后條帶的深淺判斷該處理對基因的表達造成的影響，這種判斷是存在誤差的，這時候就需要對結(jié)果條帶的灰度值進行計算并做統(tǒng)計分析——目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值，以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量，這樣得到的結(jié)果才更加準確、更有說服力。

?image J灰度分析步驟

·?打開Image J軟件，導(dǎo)入WB條帶圖片：File→Open→找到WB條帶。

·?把圖片轉(zhuǎn)化成灰度圖片，一般灰度分析的要求圖片8bit就好：Image→Type→8-bit。

·?消除背景影響：Process>Subtract Background. 選擇50基本可以。

·?設(shè)置定量參數(shù)：analyze>Set Measurements, 點擊面積area，平均密度mean gray value，和灰度值Integrated Density

·?設(shè)置定量單位?analyze>Set Scale,在“Unit of length” 邊的方框里輸入 "pixels"（像素）?

·?第一個矩形工具→選上所有條帶→analyze→Gels→select first lane

?·?分析圈中條帶analyze→Gels→plot lanes出現(xiàn)山峰樣圖。

?·?選中直線工具，將開口波峰關(guān)閉。?

·?選中魔棒工具，點擊波峰，就得出所有area值。

?·?當(dāng)測定完所有條帶，選結(jié)果中的“Edit”的“Select All”，然后復(fù)制數(shù)據(jù)“IntDen”到Excel表即可進行分析。也可以直接在Results對話框中，選擇File → Saveas，直接導(dǎo)出excel表格。在excel表格中將目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值，進行歸一化處理。

作者：海星生物

公眾號：Cas9X細胞基因敲除

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