脂質(zhì)是細胞的細胞膜成分、信號分子，也是細胞的能量來源。脂質(zhì)代謝的改變對癌癥的進展至關(guān)重要，而脂質(zhì)在癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。此外，脂質(zhì)組學(xué)正在深入了解疾病機制，并確定新的治療靶點。新的證據(jù)表明，脂質(zhì)代謝改變也在黑色素瘤的發(fā)展中區(qū)分良性皮膚腫瘤和黑色素瘤起著重要作用。

本篇為曼徹斯特大學(xué)Adam W. McMahon等研究課題組在醫(yī)學(xué)一區(qū)《Cancer Research》期刊(IF:13.312)發(fā)表了題為“Enhanced fatty acid scavenging and glycerophospholipid metabolism accompany melanocyte neoplasia progression in zebrafish”的研究成果，本文中將轉(zhuǎn)錄組分析和基于質(zhì)譜成像DESI-MS成像模式的空間代謝組學(xué)相結(jié)合，來研究致癌ras驅(qū)動的斑馬魚黑素細胞瘤中的脂肪酸攝取和脂質(zhì)代謝。轉(zhuǎn)錄組分析確定了與疾病進展相關(guān)的基因表達程序，其中包括參與脂肪酸攝取和甘油磷脂代謝的基因。同時，F(xiàn)THA的PET和DESI-MS成像均證實了脂肪酸攝取增強。DESI-MS空間代謝和常規(guī)質(zhì)譜也證實了甘油磷脂代謝的增強，從而為腫瘤脂質(zhì)代謝的異質(zhì)性提供了相應(yīng)的的見解。

研究背景

脂肪酸是復(fù)雜脂質(zhì)并入膜的基石，以及β-氧化的底物，這是一種主要的能量生成反應(yīng)。脂肪酸可以由脂肪酸合酶（FASN）從頭合成。FASN在包括黑色素瘤在內(nèi)的多種癌癥中過表達，并在幾十年來一直是藥物開發(fā)項目的目標。最近的研究表明，與其他類型的癌癥相比，攜帶長鏈脂肪酸的FATP1/SLC27A1在黑色素瘤中富集，因此強調(diào)了脂肪酸攝取對黑色素瘤進展的重要性。最近，轉(zhuǎn)基因斑馬魚被用來揭示FATP1和BRAFV600E在刺激黑素細胞瘤變方面的協(xié)同作用，而黑色素瘤細胞移植到斑馬魚中則顯示出優(yōu)先轉(zhuǎn)移到脂肪組織。

研究思路

實驗方法

研究對象：斑馬魚

1.正電子發(fā)射斷層掃描（PET）

2.解吸電噴霧電離質(zhì)譜（DESI-MS）空間代謝組學(xué)研究及分析

3.轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究及分析

4.代謝途徑的脂質(zhì)提取和質(zhì)譜分析

5.轉(zhuǎn)錄組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)分析

6.RNA分離和實時熒光定量qPCR分析

7.蛋白質(zhì)印跡法

8.免疫組化

研究結(jié)果

1.轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示了晚期黑素細胞瘤中脂質(zhì)代謝途徑的解除調(diào)控

首先作者構(gòu)建了不同級別的黑素細胞腫瘤的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。單獨表達BRAFV600E的轉(zhuǎn)基因動物發(fā)生良性黑素細胞增生，表現(xiàn)為較寬、較深的條紋；而單獨表達HRASG12V導(dǎo)致惡性黑素細胞瘤，最初在表皮水平擴張，皮下包裹全身，而非腹側(cè)表面（徑向生長期或RGP），然后垂直浸潤皮下組織（垂直生長期或VGP），主要導(dǎo)致腫瘤結(jié)節(jié)抬高(圖1a)。同時，VGP腫瘤模型的差異表達基因（DEG）數(shù)量最多，總計4429個（圖1B）。

層次聚類分析DEGs表明，RGP和VGP譜之間的關(guān)系比任何其他的雙向比較都更接近（圖1C）。但deg在RGP和VGP之間是共同的，顯示出了潛在進展（圖1D）。利用BioBDnet和BioMart將DEGs轉(zhuǎn)化為人類同源物，然后進行生物過程中的氧化石墨烯富集分析。結(jié)果顯示，代謝物的變化與19%的上調(diào)基因相關(guān)，其中脂質(zhì)代謝基因占28%（圖1e）。

圖1 | 轉(zhuǎn)錄組分析惡性黑素細胞瘤相關(guān)的基因特征

2.PET、空間代謝組分析黑素細胞腫瘤清除外源性游離脂肪酸

為了探究斑馬魚體內(nèi)組織游離脂肪酸的攝取，作者首先使用了[ 18F]-FTHA（一種放射性標記的棕櫚酸類似物）作為PET示蹤劑進行成像分析。對野生型魚在給藥2小時后進行PET掃描，結(jié)果顯示[18F]-FTHA主要是在前腹部積累（圖2A）。然而，由于空間分辨率比較有限，僅通過PET掃描很難確定[ 18F]-FTHA被占用的位置。因此，作者在PET掃描后進行DESI-MS空間代謝組成像分析，利用其高空間分辨率來確定更精確的示蹤劑位置。對野生型斑馬魚進行DESI-MS成像顯示，F(xiàn)THA主要積累在肝臟中（圖2B），膳食中的脂肪酸轉(zhuǎn)化為甘油三酯，并入脂蛋白，在體內(nèi)分布。接下來，對V12RAS轉(zhuǎn)基因斑馬魚進行PET掃描，發(fā)現(xiàn)8/8個腫瘤中[18F]-FTHA的濃度（圖2c和D），這與轉(zhuǎn)錄組學(xué)預(yù)測的V12RAS轉(zhuǎn)化的黑素細胞中脂肪酸攝取升高相一致。

圖2 | 野生型斑馬魚和斑馬魚攜帶黑色素瘤腫瘤的（[18F]）-FTHA的PET和DESI-MS成像

3.驗證研究：甘油磷脂代謝在惡性腫瘤中解除控制

對野生型皮膚、含RGP黑色素瘤皮膚和VGP腫瘤結(jié)節(jié)進行LC-MS代謝組學(xué)研究，以確定黑素細胞腫瘤進展過程中代謝物濃度的變化。與野生型皮膚相比，所有脂質(zhì)代謝類的一些物種發(fā)生了大量變化，隨著疾病進展而增加。運用代謝組學(xué)檢測到的代謝物PCA顯示野生型、RGP和VGP樣品之間有明顯的分離，負離子模式數(shù)據(jù)的分離更明顯（圖3A）。整合轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)分析，突出了VGP（圖3B）和RGP樣品中的甘油磷脂代謝途徑。采用DESI-MS空間質(zhì)譜成像方法觀察VGP黑色素瘤中的磷脂種類，同樣顯示了腫瘤和健康組織之間的甘油磷脂豐度的明顯差異，并且顯示了甘油磷脂種類的異質(zhì)性，包括腫瘤中的PE種類(圖3c和D)。

圖3 | 甘油-磷脂代謝的改變伴隨著黑素細胞腫瘤的進展

4.LPL是一個潛在的治療靶點

為了評估在人類黑色素瘤中清除脂肪酸的潛力，作者通過逆轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)RT-PCR在已建立的人類黑色素瘤細胞系中定量LPL、CD36、FABP7、FATP1和FATP2 mRNA的表達，并將其與NHMs的水平進行對比。研究發(fā)現(xiàn)：與NHM相比，所有黑色素瘤細胞系，包括NRAS和BRAF突變體、LPL轉(zhuǎn)錄均發(fā)生廣泛的倍數(shù)變化（圖4A）。此外，IHC染色陽性顯示LPL在90%或更多的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中表達（圖4B）。在77%的痣中也檢測到LPL，但主要局限于占據(jù)表皮和真皮交界處的痣細胞巢中（圖4C）。

圖4 | LPL在人黑色素瘤細胞系和腫瘤中的表達

通過在胚胎中色素沉著幾乎完全恢復(fù)的動物中跟蹤腫瘤結(jié)節(jié)的形成，作者發(fā)現(xiàn)所有被色素拯救的動物都出現(xiàn)了親本V12RAS系特有的RGP外觀（圖5A）。然而，與mCherry、CCND1相比，LPL的共表達加速了腫瘤結(jié)節(jié)的形成（圖5B）。此外，與mCherry或CCND1相比，LPL的共表達增加了腫瘤的生長速率（圖5C）。對于人類黑色素瘤細胞，使用兩種獨立的siRNA寡核苷酸敲除，LPL可在WM852細胞中減少70%，在WM266-4細胞中降低50%，但沒有影響A375細胞（圖5D）。

為了解決黑色素瘤細胞中抑制LPL的敏感性的差異，作者通過逆轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)RT-PCR和蛋白印跡分析評估了從頭脂肪酸合成所需的FASN的表達。A375細胞和WM266-4細胞中FASN的mRNA和蛋白水平顯著高于原代黑素細胞，但也顯著高于WM852細胞(圖5e)，這意味著從頭脂肪酸合成可能補充A375和WM266-4細胞的脂肪酸清除，而不是WM852細胞。WM852細胞對LPL的一種小分子抑制劑比A375細胞或WM266-4細胞都要多（圖5F）。同時，F(xiàn)ASN抑制劑C75（42）和LPL抑制劑聯(lián)合作用可協(xié)同抑制A375細胞和WM266-4細胞的生長，而不抑制WM852細胞的生長（圖5F）。

此外，F(xiàn)ASN在WM1361細胞中表達相對較低，而在WM35細胞中表達相對較高(圖5e）。與上述預(yù)測一致，WM1361細胞對LPL抑制劑敏感，而沒有添加FASN抑制劑的作用，WM35對LPL抑制劑的敏感性較低，但通過添加FASN抑制劑可致敏（圖5F）。

圖5 | LPL有助于黑色素瘤細胞的生長

研究討論

• 斑馬魚V12ras驅(qū)動的黑素細胞腫瘤的脂質(zhì)代謝發(fā)生了實質(zhì)性的變化。

• 多模態(tài)成像結(jié)合脂質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組分析顯示，斑馬魚V12ras驅(qū)動的黑素細胞腫瘤清除游離脂肪酸，并上調(diào)某些甘油磷脂的產(chǎn)生。

• 斑馬魚黑素細胞腫瘤模型和人類黑素瘤中改變的脂質(zhì)代謝基因之間的一些重疊，支持了研究中斑馬魚模型的臨床前意義。

  
  

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本文研究中結(jié)合正電子發(fā)射斷層掃描、解吸電噴霧電離質(zhì)譜的空間代謝組、代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等分析方法，發(fā)現(xiàn)了脂肪酸獲取可能作為黑色素瘤的一個治療靶點，該方法開發(fā)對監(jiān)測脂肪酸攝取具有診斷、患者分層和監(jiān)測藥理學(xué)反應(yīng)的潛力，為后續(xù)黑色素瘤的治療提供新思路。

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