腫瘤細(xì)胞的代謝重編程在肝癌的發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。有機(jī)陽(yáng)離子/肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（OCTN2）是一種鈉離子依賴(lài)性肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鈉離子非依賴(lài)性四乙基銨（TEA）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，前期研究發(fā)現(xiàn)TEA在腎癌和食管癌中促進(jìn)腫瘤惡化和代謝失調(diào)。然而，OCTN2介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝失調(diào)在肝細(xì)胞癌（HCC）中的作用尚未明確。近日，空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院在醫(yī)學(xué)一區(qū)TOP期刊《Metabolism-Clinical and Experimental》（IF=9.8/Q1）上發(fā)表的題目為“OCTN2 enhances PGC-1α-mediated fatty acid oxidation and OXPHOS to support stemness in hepatocellular carcinoma”的研究論文，通過(guò)代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析了OCTN2介導(dǎo)的HCC惡性腫瘤的機(jī)制。

奧維森為此提供了代謝組學(xué)檢測(cè)及分析服務(wù)。

研究背景

肝細(xì)胞癌（HCC）是一個(gè)巨大的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，在世界范圍內(nèi)死亡率較高，尤其是在東亞和東南亞。盡管在HCC診斷和治療領(lǐng)域取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但HCC的發(fā)病機(jī)制仍然有待闡明。因此，仍然迫切需要探究HCC的分子機(jī)制，以探索新的治療策略。更多的證據(jù)支持，在伴有變異惡行表型的腫瘤進(jìn)展中存在顯著的可塑性代謝重編程。此外，根據(jù)不同的腫瘤誘導(dǎo)模型，HCC表現(xiàn)出復(fù)雜的脂質(zhì)代謝景觀。然而，對(duì)HCC細(xì)胞中復(fù)雜的脂質(zhì)代謝失調(diào)的了解有限，盡管OCTN2在幾種癌癥進(jìn)展中的生物學(xué)作用已經(jīng)闡明，但其在HCC惡性腫瘤中的功能和具體機(jī)制仍不清楚。

本研究中采用生物信息學(xué)分析和免疫組化方法檢測(cè)OCTN2在HCC組織中的表達(dá)。通過(guò)K-M生存分析闡明OCTN2表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。通過(guò)WB、細(xì)胞球體形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖、遷移和侵襲檢測(cè)OCTN2的表達(dá)和功能。通過(guò)RNA-seq和代謝組學(xué)分析OCTN2介導(dǎo)的HCC惡性腫瘤的機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)

RNA-seq、LC-MS非靶代謝組、ChIP-seq、qPCR、WB

研究結(jié)果

1、OCTN2在體外促進(jìn)了HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

為了闡明OCTN2在細(xì)胞增殖中的作用，對(duì)HCC細(xì)胞進(jìn)行了幾種體外測(cè)定。在OCTN2敲低后，通過(guò)MTS測(cè)定細(xì)胞增殖率，SNU-368和HLE細(xì)胞中細(xì)胞增殖率降低，而Hep3B和SNU-398細(xì)胞中的OCTN2過(guò)表達(dá)加速了細(xì)胞增殖（圖1A）。集落形成結(jié)果顯示，與載體組相比，SNU-2和HLE細(xì)胞中的OCTN2敲低顯著降低集落數(shù)，而OCTN2過(guò)表達(dá)的作用與OCTN2敲低相比顯示出完全逆轉(zhuǎn)（圖1B）。為了表征OCTN2的致癌機(jī)制，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)以研究OCTN2在細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞凋亡中的功能作用。發(fā)現(xiàn)SNU-2和HLE細(xì)胞中ONTN2的下調(diào)顯著降低了細(xì)胞比例，OCTN2上調(diào)增加了S期細(xì)胞比例（圖1C）。細(xì)胞凋亡分析顯示，HCC細(xì)胞中OCTN2的下調(diào)增加了細(xì)胞凋亡率，而OCTN2的過(guò)表達(dá)具有相反的作用（圖1 D）。綜上所述，OCTN2可以通過(guò)加速細(xì)胞周期進(jìn)程和減弱細(xì)胞凋亡來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外，通過(guò)細(xì)胞傷口愈合和Transwell基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估OCTN2對(duì)HCC細(xì)胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果表明，OCTN2敲低消除了SNU-368和HLE細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。相反，OCTN2上調(diào)的Hep3B和SNU-398細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活性高于載體組（圖1E-F）。為了進(jìn)一步評(píng)估OCTN2對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響，使用免疫熒光測(cè)定和鬼筆環(huán)肽染色確定了不同OCTN2表達(dá)水平下偽足細(xì)胞形成的差異。結(jié)果表明，SNU-2和HLE細(xì)胞中OCTN2的減少減弱了片狀偽足細(xì)胞數(shù)量，而Hep3B和SNU-398細(xì)胞中OCTM2的上調(diào)增加了片狀偽足細(xì)胞數(shù)量（圖1 G）。

WB檢測(cè)，以確定與細(xì)胞增殖，凋亡，遷移和侵襲相關(guān)的幾種標(biāo)記物。G1-S檢查點(diǎn)的幾個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平在具有OCTN2敲低的HCC細(xì)胞中下調(diào)，而OCTN2上調(diào)具有相反的效果，表明OCTN2在促進(jìn)細(xì)胞周期中的作用（圖1H）。

2、OCTN2促進(jìn)體內(nèi)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解OCTN2對(duì)HCC腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。首先，使用具有不同OCTN2表達(dá)水平的HCC細(xì)胞進(jìn)行了皮下異種移植腫瘤測(cè)定。發(fā)現(xiàn)，與載體小鼠相比，SNU-368-shOCTN2組的腫瘤體積和重量減少，而OCTN2過(guò)表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了這些影響（圖2A-D）。組織學(xué)檢查證實(shí)，OCTN2的下調(diào)抑制了Ki67陽(yáng)性細(xì)胞率，而OCTN2上調(diào)顯著導(dǎo)致OCTN2敲低的相反表型，同時(shí)OCTN2的IHC染色結(jié)果得到了一致的結(jié)果（圖2E-F）。此外，OCTN2下調(diào)后，SNU-2細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移數(shù)量明顯減少。同時(shí)，Hep2B細(xì)胞中的OCTN2過(guò)表達(dá)上調(diào)了腫瘤轉(zhuǎn)移（圖1G-H）。總之，結(jié)果表明OCTN2增強(qiáng)了體內(nèi)HCC腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

3、OCTN2促進(jìn)?HCC細(xì)胞干性

為了研究OCTN2促腫瘤作用的潛在機(jī)制，在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)庫(kù)中探索了OCTN2相關(guān)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OCTN2高表達(dá)的HCC患者中EpCAM和CD24 mRNA水平高表達(dá)，它們是HCC癌癥干細(xì)胞（CSC）中維持干性的表面生物標(biāo)志物（圖3A），此外，與HCC CSC干性維持相關(guān)的幾種生物標(biāo)志物的mRNA水平也與OCTN2顯著正相關(guān)。因此，推測(cè)高OCTN2表達(dá)是否與HCC CSCs的干性維持有關(guān)。采用球體形成實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定OCTN2對(duì)癌癥干性特性的影響。與載體組相比，SNU-368和HLE細(xì)胞中的OCTN2敲除顯著降低了球體數(shù)量，而相對(duì)于空載體轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞，OCTN2過(guò)表達(dá)增加了球體數(shù)量（圖3B）。之后，對(duì)球體進(jìn)行固定以進(jìn)行免疫熒光染色，相對(duì)于非球體附著的HCC細(xì)胞，OCTN2的表達(dá)更高，并且與球狀HCC細(xì)胞中的SALL4表達(dá)呈正相關(guān)（圖3C）。體內(nèi)稀釋的異種移植腫瘤形成測(cè)定顯示，與對(duì)照組相比，具有OCTN2表達(dá)敲除的HCC細(xì)胞在BALB/c裸鼠中的致瘤能力降低（圖3F-H）。以上結(jié)果證實(shí)，OCTN上調(diào)可以增強(qiáng)HCC細(xì)胞的干性，維持表型。

4、OCTN2?增強(qiáng)氧化磷酸化 （OXPHOS） 和脂肪酸β氧化 （FAO） 促進(jìn)?HCC CSC?的干性

為了闡明OCTN2上調(diào)如何維持HCC CSC干性，研究中進(jìn)行了RNA-seq和LC-MS非靶向代謝組測(cè)定。對(duì)OCTN2敲低的SNU-368細(xì)胞與正常OCTN2表達(dá)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)KEGG注釋分析，揭示了OCTN2與OXPHOS密切相關(guān)（圖4A）。相應(yīng)地，Seahorse XFe分析儀的耗氧率（OCR）測(cè)定結(jié)果顯示，OCTN2敲低降低了OCR，OCTN2過(guò)表達(dá)增加了OCR（圖4B-C）。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組的GSEA分析，研究OCTN2是否可以促進(jìn)HCC細(xì)胞的糖酵解，結(jié)果表明，OCTN2敲低會(huì)減弱糖酵解途徑（圖5A），而代謝組學(xué)結(jié)果顯示并未影響到糖酵解途徑(圖5B)。之后進(jìn)行了細(xì)胞外酸化率（ECAR）測(cè)定，以研究OCTN2在HCC細(xì)胞糖酵解活性中的作用。為了研究OCTN2在促進(jìn)OXPHOS信號(hào)傳導(dǎo)中的作用時(shí)，HCC細(xì)胞如何平衡氧化還原穩(wěn)態(tài)以促進(jìn)惡性腫瘤，使用shOCTN2 RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了與線(xiàn)粒體本身的功能相關(guān)的GSEA分析，包括膜電位，線(xiàn)粒體過(guò)程，ROS產(chǎn)生和線(xiàn)粒體解毒。細(xì)胞對(duì)活性氧自由基的反應(yīng)和活性氧的解毒途徑富集。因此，通過(guò)檢測(cè)ROS的總量，線(xiàn)粒體的ROS含量，SOD、CAT和GPX三種主要抗氧化酶的活性，結(jié)果顯示，OCTN2上調(diào)或下調(diào)增強(qiáng)或降低了總ROS和線(xiàn)粒體ROS的產(chǎn)生，也增強(qiáng)或減弱了三種抗氧化酶的活性。OCTN2在HCC細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)OXPHOS能力，同時(shí)提高SOD、CAT和GPX的活性，以維持線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)。此外，如圖5D所示，基于代謝組學(xué)結(jié)果對(duì)不同肉堿進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果表明，在SNU-368細(xì)胞中敲低OCTN2顯著降低了幾種肉堿的含量。此外，對(duì)HCC細(xì)胞中l(wèi)-肉堿和棕櫚酰肉堿含量的定量檢測(cè)表明，穩(wěn)定的OCTN2敲低SNU-368細(xì)胞和OCTN2過(guò)表達(dá)Hep3B細(xì)胞分別降低或增加了細(xì)胞l-肉堿和棕櫚酰肉堿含量（圖4E-F）。因此，推測(cè)OCTN2是否會(huì)影響FAO表達(dá)。通過(guò)OCR測(cè)定發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于BSA對(duì)照，穩(wěn)定的OCTN2敲低SNU-368和HLE細(xì)胞或OCTN2過(guò)表達(dá)Hep3B和SNU-398細(xì)胞降低或增加了FAO水平（圖4G）。此外，還通過(guò)BODIPY 493/503染色分析了脂滴含量的變化。結(jié)果表明，OCTN2的下調(diào)或上調(diào)增加或減少HCC細(xì)胞中的脂滴含量，表明OCTN2表達(dá)可以通過(guò)動(dòng)員脂滴發(fā)揮其促進(jìn)FAO的作用?？傊?，OCTN2可以共同增強(qiáng)OXPHOS和FAO在HCC細(xì)胞中的作用。

為了驗(yàn)證OCTN2是否促進(jìn)HCC CSC干性，使用埃托莫（一種著名的FAO抑制劑）對(duì)穩(wěn)定的OCTN2過(guò)表達(dá)Hep3B和SNU-398細(xì)胞進(jìn)行了幾項(xiàng)體外測(cè)定。依托莫昔顯著消除了OCTN2過(guò)表達(dá)增強(qiáng)的Hep3B和SNU-398細(xì)胞的增殖和侵襲（圖4H-I）；同時(shí)顯著減少了OCTN2過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞球體形成，表明FAO有助于OCTN2過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的HCC CSCs干性維持（圖4J）。上述結(jié)果證實(shí)，OCTN2促進(jìn)HCC細(xì)胞依賴(lài)性O(shè)XPHOS和FAO信號(hào)傳導(dǎo)的干性。

5、OCTN2?通過(guò)PGC-1α?介導(dǎo)的線(xiàn)粒體生物發(fā)生信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)?HCC惡性腫瘤

通過(guò)RT-qPCR測(cè)定mtDNA含量，MitotrackerGreen染色檢測(cè)HCC細(xì)胞中的線(xiàn)粒體質(zhì)量，以驗(yàn)證OCTN2可以作為線(xiàn)粒體生物發(fā)生的啟動(dòng)子的潛力。結(jié)果表明，與SNU-368-shCtrl細(xì)胞相比，SNU-368-shOCTN2細(xì)胞的線(xiàn)粒體DNA含量和線(xiàn)粒體質(zhì)量顯著降低。同時(shí)，OCTN2過(guò)表達(dá)增加了線(xiàn)粒體DNA含量和線(xiàn)粒體質(zhì)量（圖6A–B）。為了探索TFAM，PGC-1α，c-Myc和PPARγ是否與OCTN2介導(dǎo)的線(xiàn)粒體生物發(fā)生和OXPHOS相關(guān)，在OCTN2上調(diào)或下調(diào)的HCC細(xì)胞中檢測(cè)了它們的表達(dá)。結(jié)果表明，在OCTN2敲低的SNU-368細(xì)胞中，PGC-1α的表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上都顯著下調(diào)。相反，PGC-1α在OCTN2過(guò)表達(dá)的Hep3B細(xì)胞中顯著上調(diào)（圖6C-D）。此外，PGC-1αmRNA和蛋白質(zhì)水平的變化在HLE和SNU-398細(xì)胞中得到證實(shí)（圖6D）。Spearman相關(guān)分析結(jié)果表明OCTN2與PGC-1α表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.440，p < 0.001）。

此外，還研究了PGC-1α是否有助于OCTN2介導(dǎo)的CSCs維持相關(guān)基因的上調(diào)。如圖6F所示，PGC-1α過(guò)表達(dá)顯著提高了EpCAM、SALL4、CD24、CD133和OCT4的表達(dá)，OCTN2敲低下調(diào)了這些表達(dá)。SNU-2和HLE細(xì)胞中PGC-1α上調(diào)顯著逆轉(zhuǎn)了OCTN368敲低介導(dǎo)的線(xiàn)粒體生物發(fā)生，OXPHOS，F(xiàn)AO和球體形成的減少，而shRNA對(duì)PGC-1α的衰減減弱了OCTN2過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的線(xiàn)粒體生物發(fā)生增加（圖6G），F(xiàn)AO和Hep3B和SNU-398細(xì)胞中的球體形成（圖6H–J）。此外，對(duì)經(jīng)尾靜脈注射HCC細(xì)胞誘導(dǎo)的異種移植物腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移進(jìn)行了體內(nèi)測(cè)定，以確定PGC-1α參與OCTN2是否促進(jìn)HCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，PGC-1α敲低顯著消除了OCTN2過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的皮下異種移植HCC腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的增強(qiáng)。同時(shí)，PGC-1α上調(diào)顯示出相反的效果（圖6K-L）。結(jié)果表明，OCTN2通過(guò)PGC-1α信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)HCC細(xì)胞的惡性腫瘤。

6、米屈肼可在體外和體內(nèi)抑制HCC細(xì)胞惡性腫瘤

Mildronate（米屈肼）是一種選擇性O(shè)CTN2拮抗劑，用于心臟保護(hù)領(lǐng)域。為了驗(yàn)證米屈肼在HCC中可能的治療效果，我們?cè)u(píng)估了米屈肼在體外和體內(nèi)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的功能。結(jié)果顯示，米屈肼治療顯著減少HLE和SNU-368細(xì)胞中的HCC集落數(shù)量、侵襲細(xì)胞數(shù)量以及球體形成數(shù)（圖7A-C）。另一方面，與DMSO治療組相比，米屈肼治療顯著抑制異種移植腫瘤的體積和重量、減少肺轉(zhuǎn)移病變的數(shù)量（圖7D-G）。與每種單一藥物的效果相比，米屈肼聯(lián)合索拉非尼治療可減少腫瘤生長(zhǎng)。這些數(shù)據(jù)表明，米屈肼抑制OCTN2可能是肝細(xì)胞癌的前瞻性策略。

研究結(jié)論

1、OCTN2在HCC中顯著上調(diào)，并且與預(yù)后不良密切相關(guān)。

2、OCTN2上調(diào)促進(jìn)了體外并增加了肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

3、OCTN2通過(guò)增加脂肪酸氧化和氧化磷酸化來(lái)促進(jìn)HCC的癌干細(xì)胞樣特性。

4、PGC-1α信號(hào)傳導(dǎo)參與了OCTN2過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的HCC癌癥干細(xì)胞樣特性。

5、用OCTN2抑制劑米屈肼治療顯示出對(duì)HCC的治療影響。

參考文獻(xiàn)

[1]Yang Tao, Liang Ning, Zhang Jiahao,?et al. OCTN2 enhances PGC-1α-mediated fatty acid oxidation and OXPHOS to support stemness in hepatocellular carcinoma[J]. Metabolism, 2023, 147: 155628.