Broad研究所的著名學(xué)者張鋒教授和他在Broad研究所，麻省理工學(xué)院（MIT）麥戈文腦科學(xué)研究所（McGovern Institute for Brain Research）的合作伙伴一起，公布了他們開(kāi)發(fā)的新一代新冠病毒CRISPR檢測(cè)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程。今年2月，張鋒教授和他的合作伙伴曾經(jīng)開(kāi)發(fā)出一項(xiàng)基于CRISPR的新冠病毒檢測(cè)技術(shù)，不需要復(fù)雜的設(shè)備，三步檢測(cè)僅需約1個(gè)小時(shí)，就能檢查出新冠病毒RNA的存在。

這款最新的檢測(cè)手段比2月份的檢測(cè)技術(shù)更進(jìn)一步，檢測(cè)過(guò)程中不需要從患者樣本中純化RNA，并且將檢測(cè)新冠病毒所需的化學(xué)反應(yīng)步驟在一個(gè)試管中完成。研發(fā)團(tuán)隊(duì)將它命名為STOP（SHERLOCK Testing in One Pot）。在檢驗(yàn)12個(gè)新冠病毒陽(yáng)性和5個(gè)新冠病毒陰性樣本的實(shí)驗(yàn)中，這一檢測(cè)達(dá)到100%的特異性和97%的靈敏度。不過(guò)科學(xué)家們也強(qiáng)調(diào)，這一檢測(cè)方法還沒(méi)有獲得FDA的批準(zhǔn)，尚不能用于臨床上對(duì)新冠病毒感染的診斷。

利用CRISPR檢驗(yàn)新冠病毒的技術(shù)原理，目前，診斷新冠病毒感染的主要檢測(cè)手段是qPCR，然而，qPCR所需的試劑和設(shè)備并不是總是容易獲得，而且樣本通常要運(yùn)送到中央實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行檢測(cè)，可能延誤對(duì)患者的診斷和治療時(shí)間。為了推進(jìn)對(duì)疾病的即時(shí)（point-of-care）診斷，研究人員力圖使用CRISPR編輯技術(shù)開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)易、靈敏的分子診斷檢測(cè)。張鋒教授團(tuán)隊(duì)在2017年于《科學(xué)》雜志上發(fā)表的基于CRISPR的SHERLOCK技術(shù)。這個(gè)技術(shù)與夏洛克·福爾摩斯同名，為“Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing”技術(shù)的縮寫(xiě)。從名字上看，它具有特異的高靈敏度。

SHERLOCK的核心是一種叫做Cas13a的蛋白酶和與其結(jié)合的向?qū)NA。根據(jù)新冠病毒的RNA序列，研究人員們精心設(shè)計(jì)了能夠靶向新冠病毒特異性序列的向?qū)NA。理論上講，只要樣本里有新冠病毒所對(duì)應(yīng)的RNA，向?qū)NA就能對(duì)其進(jìn)行精準(zhǔn)的識(shí)別，并激活與其結(jié)合的Cas13a蛋白酶。Cas13a是一種很有趣的酶，一旦被激活，它就會(huì)不分青紅皂白，切開(kāi)所遇到的任何RNA分子。也正是利用這種特性，研究人員們?cè)跇颖纠镞€會(huì)添加一種通過(guò)RNA相連接的特殊分子。一旦Cas13a得到激活，這種特殊分子上的RNA就會(huì)被切斷。這樣一來(lái)，通過(guò)確認(rèn)這些分子有沒(méi)有被切斷，我們就能知道最初的樣本里有沒(méi)有新冠病毒的存在。

后續(xù)的檢測(cè)步驟與市場(chǎng)上的懷孕檢測(cè)很相似，將反應(yīng)后的樣本滴在能夠識(shí)別“完整分子”和“切斷分子”的試紙上，如果樣本里不存在新冠病毒，那么試紙標(biāo)識(shí)“完整分子”的較低位置上，就會(huì)出現(xiàn)一條條帶；相反，如果樣本里真的有新冠病毒對(duì)應(yīng)的RNA，那么在代表“切斷分子”的較高位置上，會(huì)出現(xiàn)另一條條帶。通過(guò)條帶位置的不同，我們很容易就能確認(rèn)新冠病毒的存在與否。

張鋒教授和他的合作伙伴在今年2月發(fā)布的新冠病毒檢測(cè)技術(shù)就是基于這一原理。隨后，加州舊金山大學(xué)（UCSF）的Charles Chiu教授與Mammoth Biosciences公司的聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)，以及阿根廷的布宜諾斯艾利斯大學(xué)和CASPR Biotech的聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)也開(kāi)發(fā)了基于Cas12的新冠病毒CRISPR檢測(cè)技術(shù)。然而，這些基于CRISPR的新冠病毒檢測(cè)都需要兩個(gè)反應(yīng)步驟，第一個(gè)步驟是使用等溫?cái)U(kuò)增（isothermal amplification）反應(yīng)擴(kuò)增RNA的數(shù)量，然后將擴(kuò)增的樣本加入到包含Cas酶和其它反應(yīng)試劑的試管中進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。這不但增加了檢測(cè)流程的復(fù)雜性，而且更多的樣本轉(zhuǎn)移步驟可能帶來(lái)的污染。將等溫?cái)U(kuò)增和Cas酶反應(yīng)合二為一的STOPCovid檢測(cè) 因此，張鋒教授和他的合作伙伴致力于開(kāi)發(fā)一種更為簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段，讓擴(kuò)增RNA數(shù)目的等溫?cái)U(kuò)增步驟和Cas酶檢測(cè)的化學(xué)反應(yīng)能夠在同一個(gè)試管中進(jìn)行。為此，他們選擇了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）作為擴(kuò)增RNA的方法。這一選擇也有其實(shí)用方面的原因，因?yàn)長(zhǎng)AMP所需的試劑并不難于獲取。然而LAMP反應(yīng)需要在溫度為60℃的反應(yīng)條件下進(jìn)行，而Cas13a在這一溫度下不夠穩(wěn)定。研究人員找到了名為AapCas12b的Cas酶，能夠在LAMP反應(yīng)條件下維持足夠的活性，同時(shí)對(duì)指導(dǎo)RNA和反應(yīng)中的添加劑進(jìn)行了優(yōu)化，讓Cas酶介導(dǎo)的檢測(cè)步驟維持足夠的靈敏度。在實(shí)驗(yàn)條件下，這一檢測(cè)的下限為100個(gè)新冠病毒RNA分子。研究人員同時(shí)簡(jiǎn)化了提取RNA的步驟，只需要在含有新冠病毒的咽拭子或唾液樣本中加入裂解病毒，釋放RNA的試劑，無(wú)需純化分離RNA，就可以將釋放的病毒RNA用于檢測(cè)。

STOPCovid在檢測(cè)患者樣本時(shí)表現(xiàn)出100%特異性

在今年2月發(fā)布的研究中，由于患者樣本的稀缺，研究人員只使用合成的RNA對(duì)新冠病毒CRISPR檢測(cè)的表現(xiàn)進(jìn)行了評(píng)估。這次，研究人員使用12個(gè)新冠病毒陽(yáng)性和5個(gè)新冠病毒陰性患者咽拭子樣本對(duì)STOPCovid檢測(cè)的特異性和靈敏度進(jìn)行了檢驗(yàn)。每個(gè)樣本都進(jìn)行了三重測(cè)試（triplicate）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在5個(gè)新冠病毒陰性的樣本中，STOPCovid沒(méi)有給出任何假陽(yáng)性結(jié)果，而在12個(gè)新冠病毒陽(yáng)性樣本中，STOPCovid在11個(gè)樣本的三次測(cè)試中都給出陽(yáng)性結(jié)果，在1個(gè)樣本的三次測(cè)試中兩次給出陽(yáng)性結(jié)果。研究人員表示，他們已經(jīng)準(zhǔn)備了一些初始試劑盒，能夠讓其它的研究人員進(jìn)一步開(kāi)發(fā)這一檢測(cè)平臺(tái)。研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)與美國(guó)FDA進(jìn)行交流，探索獲得緊急使用授權(quán)（EUA）所需要的步驟。張鋒教授在訪談中表示，這一檢測(cè)的獨(dú)特之處在于將化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)化為一個(gè)步驟，從而防治在多步反應(yīng)中因?yàn)檗D(zhuǎn)移液體可能帶來(lái)的樣本污染。這使它更適合作為即使檢測(cè)使用。