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今天推薦的是由廈門市婦科疾病研究與診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨廈門大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科和廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院在2020年發(fā)表于Reproductive Biology and Endocrinology(2020IF：3.235，JCRQ1)的一篇文章，通訊作者是Qiong-Hua Chenand和Qing-Xi Chen教授，人肝細(xì)胞癌3D器官型培養(yǎng)模型。

文章摘要

背景：子宮內(nèi)膜異位癥是一種良性的婦科疾病，具有明顯的雌激素依賴性，無炎癥反應(yīng)。原發(fā)性子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞在子宮內(nèi)膜異位癥研究中的應(yīng)用受限于激素和細(xì)胞因子反應(yīng)性的短壽命分化。本研究的目的是建立和表征永生化人子宮內(nèi)膜異位基質(zhì)細(xì)胞(ihESCs)。

方法：子宮內(nèi)膜異位癥樣本取自卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者，從子宮內(nèi)膜異位癥組織中分離原代子宮內(nèi)膜異位基質(zhì)細(xì)胞。原代細(xì)胞用慢病毒感染建立端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)誘導(dǎo)的永生化細(xì)胞，定量檢測(cè)mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)和Western Blot，CCK-8測(cè)定和EdU標(biāo)記測(cè)定來評(píng)估ihESCs的生長(zhǎng)情況。進(jìn)行核型測(cè)定以檢測(cè)ihESCs的染色體?？寺⌒纬蓽y(cè)定和裸鼠致瘤性測(cè)定用于評(píng)估結(jié)腸形成和腫瘤發(fā)生能力。

結(jié)果：ihESCs通過慢病毒感染持續(xù)過表達(dá)hTERT，壽命顯著延長(zhǎng)至31代。ihESCs的形態(tài)、增殖和核型保持不變。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志物、雌激素代謝蛋白和雌/孕激素的表達(dá)受體(ERs和PRs)未發(fā)生改變。此外，雌激素的治療增加了 ihESCs 的增殖和 EMT。 脂多糖(LPS)和IL-1β顯著誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。 ihESCs的克隆形成能力與原代細(xì)胞一致，遠(yuǎn)低于Ishikawa細(xì)胞。 此外，裸鼠致瘤性測(cè)定表明，ihESCs 不能觸發(fā)腫瘤形成。

結(jié)論：本研究建立并表征了永生化子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞系，其壽命更長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)和生理功能保持原代細(xì)胞，永生化細(xì)胞對(duì)雌激素和炎癥反應(yīng)保持正常反饋。此外，永生化細(xì)胞不具有致瘤能力。因此，ihESCs 可用作體外細(xì)胞工具來研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制。

研究背景

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡女性常見的婦科疾病，定義為子宮內(nèi)膜存在于子宮位置之外. 估計(jì)有10% 的育齡婦女可能患有子宮內(nèi)膜異位癥. 子宮內(nèi)膜異位癥的出現(xiàn)一般伴有慢性盆腔痛經(jīng)痛嚴(yán)重性交困難，甚至不孕。據(jù)估計(jì)，47%的不孕婦女有子宮內(nèi)膜異位癥。而且，子宮內(nèi)膜異位癥的高復(fù)發(fā)率需要3次或以上的手術(shù)。因此，子宮內(nèi)膜異位癥對(duì)大量女性患者產(chǎn)生負(fù)面影響，并間接影響醫(yī)療保健系統(tǒng)和社會(huì)。

盡管報(bào)道的許多因素與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生密切相關(guān)，但該病的病因尚不清楚。關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的致病學(xué)說，月經(jīng)逆行假說是最公認(rèn)的版本，其中子宮內(nèi)膜組織的逆行性月經(jīng)通過通暢脫落。輸卵管進(jìn)入腹膜腔，然后在異位部位粘附侵襲和增殖。這些過程與家族遺傳激素反應(yīng)的背景和免疫因素有關(guān)。

子宮內(nèi)膜異位癥被認(rèn)為是雌激素和炎癥依賴性疾病。據(jù)報(bào)道，在位子宮內(nèi)膜組織中芳香酶水平的增加允許異位組織植入腹膜表面， Capellino 等人都聲稱雌激素通過其功能性受體調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。發(fā)現(xiàn) ER 通過增加 IL-1β來抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并促進(jìn)炎癥，從而增強(qiáng)細(xì)胞粘附和異位子宮內(nèi)膜異位組織的增殖。 因此，在子宮內(nèi)膜異位病變的建立過程中，雌激素和炎癥的刺激是相互有益的。

為了研究子宮內(nèi)膜異位癥的分子機(jī)制，培養(yǎng)的人原代子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞是理想的體外工具。然而，原代子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞的適用性在很大程度上受到細(xì)胞培養(yǎng)過程中去分化的限制，包括激素和細(xì)胞因子反應(yīng)性的喪失，以及壽命短。本研究的目的是建立和表征hTERT誘導(dǎo)的永生化子宮內(nèi)膜異位造口細(xì)胞系(ihESCs)，該細(xì)胞系保持原始形態(tài)和增殖、EMT標(biāo)志物、雌激素合成酶和雌激素/孕激素受體在ihESCs 保持不變。此外，ihESCs含有正常數(shù)量的染色體，并且通過致瘤性測(cè)定證實(shí)沒有惡性轉(zhuǎn)化。

研究?jī)?nèi)容

1.慢病毒感染建立hTERT誘導(dǎo)的永生化子宮內(nèi)膜異位基質(zhì)細(xì)胞

使用慢病毒來增加原發(fā)性子宮內(nèi)膜異位基質(zhì)細(xì)胞的 hTERT 表達(dá)。如圖1a所示，紅色熒光蛋白(RFP)作為分子示蹤劑，在15和25代的ihESCs中穩(wěn)定表達(dá)。進(jìn)一步的研究被用來檢測(cè)來自不同代系的 ihESCs 中 hTERT 的表達(dá)。在圖 1b 和 c 中，與原代細(xì)胞相比，ihESCs 中 hTERT 的 mRNA 和蛋白質(zhì)均顯著增加。此外，光學(xué)顯微鏡(上圖1d)和掃描電鏡(下圖1d)觀察到ihESCs和原代基質(zhì)細(xì)胞之間沒有明顯的細(xì)胞形態(tài)變化。為了記錄ihESCs和原代細(xì)胞的壽命，連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果表明，達(dá)到 31 代的 ihESC 的壽命比原代細(xì)胞的 14 代長(zhǎng)得多(圖 le)。

圖1. 通過慢病毒轉(zhuǎn)染 hTERT 建立永生化人子宮內(nèi)膜異位造口細(xì)胞 (ihESCs)。 a 觀察受感染細(xì)胞的紅色熒光以估計(jì)感染效率。 b hTERT mRNA在第5、15和25代ihESC中的表達(dá)。 通過 Western Blot 檢測(cè)到來自不同傳代的 ihESCs 的 c hTERT 蛋白水平。 d 使用光學(xué)顯微鏡(上)和掃描電子顯微鏡(下)觀察到的 ihESC 的形態(tài)。 e 原代細(xì)胞和 ihESC 的壽命。 數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。 **P < .001, ***P < .0001。

2. ihESCs的細(xì)胞生理與原代細(xì)胞相比保持不變

為進(jìn)一步探討ihESCs的細(xì)胞生理是否發(fā)生增殖變化，并檢測(cè)了不同的標(biāo)記蛋白。如圖 2a 所示，ihESCs 的增殖活性非常類似于原代細(xì)胞。 ihESCs中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志物的表達(dá)與原代細(xì)胞一致(圖2b)。此外，包括COX-2、HSD17B1和CYP17A1在內(nèi)的雌激素代謝蛋白與原代細(xì)胞保持相似。 ERs和PRs的表達(dá)也處于原始水平(圖2c)。此外，ihESCs維持Vimentin的高表達(dá)和Cytokeratin 18的低表達(dá)，這表明ihESCs的間充質(zhì)細(xì)胞特征是頑強(qiáng)的(圖2d)。進(jìn)一步檢查ihESC的染色體，進(jìn)行核型分析。如圖2eihESCs 呈現(xiàn)正常數(shù)量的23 對(duì)染色體。

圖.2. 與原代基質(zhì)細(xì)胞相比，ihESCs 的表型和標(biāo)記蛋白保持不變。 a 通過 CCK-8 測(cè)定法檢測(cè)到的 ihESC 和原代基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。 b 來自原代造口細(xì)胞和 ihESCs 的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)表達(dá)。 c 原代細(xì)胞和 ihESC 中雌激素代謝蛋白和雌激素/孕激素受體蛋白的水平。 d 通過免疫細(xì)胞化學(xué) (ICC) 評(píng)估上皮和間充質(zhì)細(xì)胞的鑒定。 e ihESCs的染色體核型分析和分選結(jié)果(右)

3. 正常的雌激素反應(yīng)保持在 ihSC 中

為了證明 ihESCs 對(duì)雌激素刺激的反應(yīng)，使用 200nM 雌激素治療 ihESCs。如圖 3a 所示，雌激素治療顯著促進(jìn)了 ihESCs 的增殖。雌激素對(duì) ihESCs 的刺激增加了 EdU 標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量，這表明雌激素可以增強(qiáng) ihESCs 的細(xì)胞分裂(圖 3b 和 c)。此外，雌激素降低了 Cytokeratin 18 和 E-cadherin 蛋白的表達(dá)，但增強(qiáng)了間充質(zhì)標(biāo)記蛋白的水平(圖3d)。Thusestrogen促進(jìn)ihESCs的增殖和EMT，這表明ihESCs對(duì)雌激素保持正常反應(yīng)。

圖3. 在 ihESCs 中發(fā)現(xiàn)了正常的雌激素反應(yīng)和炎癥。 a 在雌激素刺激下 ihESCs 的增殖。 b EdU 標(biāo)記的測(cè)定用于監(jiān)測(cè)用雌激素處理的 ihESC 的細(xì)胞分裂。 c EdU 檢測(cè)的定量分析。 d 雌激素處理后來自 ihESCs 的 EMT 標(biāo)志物的蛋白質(zhì)表達(dá)。 刺激 LPS 的 ihESCs 中炎癥因子的 mRNA (e) 和蛋白質(zhì) (f) 表達(dá)。 來自用 IL-1β 處理的 ihESCs 的炎癥因子的 mRNA (g) 和蛋白質(zhì) (h)。 數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。 *P < .05，**P < .001，***P < .0001

4. 在 ihESC 中檢測(cè)到炎癥反應(yīng)

為了驗(yàn)證ihESCs的炎癥反應(yīng)，分別使用100ng/ml LPS和10ng/ml IL-1β來誘導(dǎo)炎癥。如圖 3e 和 f 的結(jié)果，LPS 顯著促進(jìn)了 IL-1IL-6、IL-10 和 MCP-1 的表達(dá)。這些炎癥因子的 mRNA 和蛋白質(zhì)隨著 IL-1B 的處理而顯著增加(圖 3g 和h)。 因此，ihESCs 中保留了正常的炎癥反應(yīng)。

圖 4. ihESC 不會(huì)惡性轉(zhuǎn)化以觸發(fā)腫瘤。 用于評(píng)估 ihESCs 致癌潛力的集落形成試驗(yàn)。 b 進(jìn)行裸鼠致瘤性測(cè)定以評(píng)估 ihESC 的致瘤能力

5. ihESCs 不具備致瘤能力

為了確定ihESCs是否為惡性轉(zhuǎn)化，進(jìn)行了集落形成試驗(yàn)和裸鼠致瘤性試驗(yàn)。如圖4a所示，ihESCs的克隆形成能力與原代細(xì)胞一樣弱，遠(yuǎn)低于子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞。此外，與誘導(dǎo)腫瘤形成的Ishikawa細(xì)胞不同，ihESCs和原代間質(zhì)細(xì)胞均不能引發(fā)腫瘤的發(fā)生(圖.4b)。因此，ihESCs 保留了原代細(xì)胞的特征并且沒有惡性轉(zhuǎn)化。

結(jié)論與討論

本研究通過過表達(dá)hTERT建立了永生化人子宮內(nèi)膜異位基質(zhì)細(xì)胞(ihESCs)，永生化細(xì)胞的壽命超過30代，比原代細(xì)胞長(zhǎng)得多。ihESCs的形態(tài)和增殖保持不變。EMT標(biāo)志物的表達(dá)，雌激素代謝ihESCs 中的蛋白質(zhì)和雌激素/孕激素受體與原代細(xì)胞相比沒有變化。 ihESCs的染色體部分核型保持正常。在ihESCs中觀察到雌激素和炎癥反應(yīng)的正常反饋。此外， ihESCs沒有惡性轉(zhuǎn)化引發(fā)腫瘤的形成。因此，我們建立了具有穩(wěn)定特性和功能的永生化子宮內(nèi)膜異位基質(zhì)細(xì)胞，這可能是一種實(shí)用的細(xì)胞工具。

根據(jù)關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥高通量測(cè)序的大量報(bào)道，發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個(gè)在子宮內(nèi)膜異位癥中異常表達(dá)的基因與正常和在位子宮內(nèi)膜相比，子宮內(nèi)膜異位癥病變顯著突變，包括炎癥反應(yīng)的變化激素失調(diào)、增殖和凋亡紊亂、促進(jìn)血管生成和EMT。因此，子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞在子宮內(nèi)膜異位癥的機(jī)制研究中更受模型細(xì)胞的重視，建立具有穩(wěn)定特性和長(zhǎng)壽命的模型細(xì)胞是可觀的因此建立永生化子宮內(nèi)膜異體細(xì)胞是為研究提供細(xì)胞工具的有效途徑。本研究建立的永生化細(xì)胞ihESCs保持形態(tài)增殖和EMT標(biāo)記不變，表明永生化過程不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和類型。另一方面，眾所周知，與正常和在位子宮內(nèi)膜相比，子宮內(nèi)膜異位病灶中的雌激素顯著增加，并且雌激素合酶的顯著增加與子宮內(nèi)膜異位癥的復(fù)發(fā)密切相關(guān)28-30Ou結(jié)果表明，這些雌激素合酶包括COX-2、HSD17B1和CYP17A1保持不變。與原代細(xì)胞一致。此外，雌/孕激素受體的表達(dá)沒有改變，說明雌、孕激素的功能途徑保持完整，而且永生化細(xì)胞的染色體數(shù)目保持正常，表明基因不受永生化的影響。因此，這些結(jié)果表明， ihESCs 保留了作為主要子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和基因特征。

子宮內(nèi)膜異位癥被認(rèn)為是雌激素依賴性和炎癥性疾病[2930]。雌激素主要通過其核受體刺激子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞的增殖[31]。而我們之前的研究發(fā)現(xiàn)雌激素顯著促進(jìn)EMT[32]。本研究中雌激素刺激明顯促進(jìn)了ihESCs的增殖和EMT，這表明了原始能力對(duì)原代細(xì)胞雌激素的反應(yīng)仍然存在于ihESCs中。另外LPS和IL-1B的處理可以引發(fā)ihESCs的明顯炎癥，這表明ihESCs中存在炎癥反應(yīng)。因此，ihESCs足以用于研究雌激素和炎癥的作用和機(jī)制。子宮內(nèi)膜異位癥。

先前的一項(xiàng)研究分析了與雌激素/孕酮生物合成和信號(hào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)以及不同永生化人子宮內(nèi)膜異位癥上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子相關(guān)的眾多基因表達(dá)。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染 hTERT 建立了永生化子宮內(nèi)膜異位癥上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，從而保持雌激素和孕激素受體的表型和表達(dá)的主要特征。然而，這些永生化細(xì)胞中細(xì)胞形態(tài)生理學(xué)和惡性轉(zhuǎn)化的變化缺乏識(shí)別。為了全面評(píng)價(jià)我們的永生化細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞形態(tài)增殖EMT標(biāo)志物和不同的細(xì)胞生理進(jìn)行監(jiān)測(cè)，未發(fā)生變化。此外，核型分析和成瘤實(shí)驗(yàn)表明，ihESCs沒有惡性轉(zhuǎn)化，是可靠的模型細(xì)胞?？傊?，本研究建立了永生化的子宮內(nèi)膜異位癥基質(zhì)細(xì)胞，并表明這些細(xì)胞具有更長(zhǎng)的壽命、主要的生理特征并且沒有惡性轉(zhuǎn)化。因此，胚胎干細(xì)胞可能用作證明子宮內(nèi)膜異位癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>