適度的炎癥對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的傷口愈合是必不可少的。在病理情況下，如糖尿病，長(zhǎng)期和難治性傷口與過(guò)度炎癥有關(guān)，表現(xiàn)為持續(xù)的促炎巨噬細(xì)胞狀態(tài)。然而，其機(jī)制尚不清楚。

2023年7月，中山大學(xué)唐冰、鄧務(wù)國(guó)及胡志成團(tuán)隊(duì)合作在Cell Reports Medicine?（IF14.3）發(fā)表了題為“Targeting phenylpyruvate restrains excessive NLRP3 inflammasome activation and pathological inflammation in diabetic wound healing”的研究成果，利用代謝組學(xué)技術(shù)，以糖尿病足潰瘍和非糖尿病傷口皮膚組織為研究對(duì)象，提出了一種靶向苯丙酮酸的潛在策略，以防止糖尿病傷口過(guò)度炎癥。中科新生命為研究提供非靶向代謝組學(xué)和H650高通量靶向代謝組學(xué)技術(shù)支持。

?研究材料

糖尿病足潰瘍（DFU）和非糖尿病傷口（NDW）臨床皮膚組織

?技術(shù)路線

步驟1：非靶向代謝組學(xué)分析和關(guān)鍵代謝物驗(yàn)證；

步驟2：限制苯丙氨酸攝入對(duì)炎癥和傷口愈合的影響；

步驟3：苯丙酮酸對(duì)炎癥的影響；

步驟4：LiP-SMap檢測(cè)巨噬細(xì)胞中苯丙酮酸的潛在靶標(biāo)；

步驟5：苯丙酮酸的結(jié)合靶標(biāo)對(duì)炎癥小體的影響；

步驟6：苯丙酮酸對(duì)炎癥小體活性的影響；

步驟7：巨噬細(xì)胞中苯丙酮酸的攝取方式研究。

?研究結(jié)果

1. 代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)苯丙酮酸在 DFU中積累，其能損害傷口愈合并延長(zhǎng)炎癥

將DFU和NDW臨床皮膚組織進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸代謝紊亂，其中苯丙酮酸在DFU傷口中明顯積累。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DFU傷口中炎癥小體NLRP3表達(dá)水平升高，NLRP3水平與苯丙酮酸水平呈強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系，且苯丙酮酸以劑量依賴性方式延遲傷口愈合。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，苯丙酮酸增加了促炎巨噬細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)了促炎巨噬細(xì)胞的持續(xù)極化，顯著增加了傷口中的NLRP3表達(dá)水平，并誘導(dǎo)炎癥因子水平升高。以上研究表明，苯丙酮酸會(huì)引發(fā)巨噬細(xì)胞極化失衡，導(dǎo)致炎癥增加和傷口愈合受損。

2. 限制苯丙氨酸攝入可改善持續(xù)性炎癥并有益于糖尿病傷口愈合

為進(jìn)一步探討是否可以將苯丙酮酸作為治療靶點(diǎn)來(lái)改善糖尿病創(chuàng)面的愈合，給小鼠喂食不同濃度苯丙氨酸（苯丙酮酸的上游代謝物），發(fā)現(xiàn)限制苯丙氨酸攝入減少了糖尿病傷口中苯丙酮酸的積累，并明顯加速了糖尿病傷口愈合，而體重、血糖水平和食物攝入量不受影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸攝入限制減少促炎巨噬細(xì)胞的數(shù)量，并增加了促愈合巨噬細(xì)胞的數(shù)量，抑制促炎巨噬細(xì)胞極化，降低NLRP3表達(dá)水平。以上結(jié)果表明，限制苯丙氨酸攝入可減少糖尿病傷口中苯丙酮酸的積累，減少過(guò)度炎癥，促進(jìn)愈合。

3. 苯丙酮酸可被巨噬細(xì)胞吸收并促進(jìn)促炎巨噬細(xì)胞表型

為研究苯丙酮酸如何調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化，首先確定了苯丙酮酸對(duì)糖尿病小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（BMDM）的影響：苯丙酮酸處理后， M1特征基因Nos、Tnf 和Il6的表達(dá)上調(diào)， M1標(biāo)志物CD86蛋白水平明顯升高，上清液中的IL-1β、IL-18和TNFα增多，NLRP3蛋白水平上調(diào)，培養(yǎng)基中caspase-1和IL-1β的水平增加。以上結(jié)果表明，苯丙酮酸可以進(jìn)入巨噬細(xì)胞并促進(jìn)促炎表型。

圖3苯丙酮酸被BMDM吸收并觸發(fā)促炎巨噬細(xì)胞表型

4. PPT1是苯丙酮酸的靶標(biāo)

為探索苯丙酮酸調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型的分子機(jī)制，采用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)（LiP-SMap）篩選與苯丙酮酸結(jié)合的蛋白，發(fā)現(xiàn)溶酶體途徑蛋白最豐富。對(duì)溶酶體途徑中三種最突出的蛋白質(zhì)（Ppt1，M6pr和Psap）研究發(fā)現(xiàn)，僅在Ppt1敲低后NLRP3蛋白水平顯著增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，苯丙酮酸可與PPT1蛋白結(jié)合， 并顯著降低PPT1活性。此外，把兩者結(jié)合位點(diǎn)突變后回補(bǔ)PPT1蛋白逆轉(zhuǎn)了。以上結(jié)果表明，苯丙酮酸結(jié)合并抑制PPT1蛋白活性，介導(dǎo)了苯丙酮酸誘導(dǎo)的NLRP3表達(dá)上調(diào)。

5. 苯丙酮酸通過(guò)與PPT1蛋白結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)NLRP3棕櫚?；?/strong>

PPT1是硫酯酶，可從S-?；鞍字腥コ貦八?，作者推測(cè)苯丙酮酸是否可以調(diào)節(jié)NLRP3的棕櫚?；?。研究發(fā)現(xiàn)，PPT1和NLRP3存在相互作用，PPT1缺乏時(shí)NLRP3棕櫚?；黾?，且C6是NLRP3中的主要棕櫚?；稽c(diǎn)。苯丙酮酸可增加NLRP3的棕櫚?；砑幼貦磅；种苿┖螅奖釋?duì)NLRP3的表達(dá)水平無(wú)影響。以上研究表明，苯丙酮酸可通過(guò)結(jié)合和抑制PPT1活性來(lái)增加NLRP3的棕櫚?；?。

6. 苯丙酮酸穩(wěn)定NLRP3蛋白并促進(jìn)炎癥小體活化以觸發(fā)促炎巨噬細(xì)胞表型

研究者發(fā)現(xiàn)苯丙酮酸顯著增強(qiáng)NLRP3的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，減少NLRP3自噬降解，增強(qiáng)了NLRP3和銜接蛋白ASC之間的相互作用，并且苯丙酮酸與PPT1結(jié)合促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的促炎表型。當(dāng)抑制BMDM中的NLRP3時(shí)， 苯丙酮酸無(wú)法再上調(diào)M1相關(guān)特征基因。以上研究表明，苯丙酮酸通過(guò)增強(qiáng)NLRP3的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和促進(jìn)炎癥小體活化來(lái)促進(jìn)促炎表型。

7. 苯丙酮酸以CD36依賴性方式進(jìn)入巨噬細(xì)胞

為探索BMDM中苯丙酮酸攝取的關(guān)鍵因素，作者發(fā)現(xiàn)苯丙酮酸顯著提高CD36 mRNA的表達(dá)水平，提高BMDM表面CD36受體表達(dá)；敲低潛在結(jié)合蛋白CD36后苯丙酮酸攝取顯著降低。下調(diào)CD36表達(dá)后，苯丙酮酸無(wú)法增加NLRP3表達(dá)水平或激活炎癥小體，并可逆轉(zhuǎn)苯丙酮酸誘導(dǎo)的IL-1β、IL-18和TNFα分泌增加。以上研究表明，巨噬細(xì)胞中CD36在苯丙酮酸攝取及其促炎作用中起關(guān)鍵作用。

小結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)苯丙酮酸通過(guò)CD36進(jìn)入巨噬細(xì)胞，結(jié)合并抑制PPT1蛋白的酶活性，導(dǎo)致NLRP3蛋白棕櫚?；黾樱鰪?qiáng)NLRP3蛋白的穩(wěn)定性，減少溶酶體的降解，促進(jìn)NLRP3炎性小體的活化和炎癥因子的釋放，最終引發(fā)促炎巨噬細(xì)胞表型。本研究為糖尿病傷口過(guò)度炎癥治療提出了一種新的策略，為疾病臨床治療提供了新的思路。

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