一、熒光光譜儀

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1.熒光光譜儀結(jié)構(gòu)

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熒光光譜儀(熒光分光光度計(jì))是測量熒光的儀器，主要由光源、激發(fā)單色器、樣品池、發(fā)射單色器和檢測器等組成。

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圖1 熒光光譜儀及其主要組件示意圖

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(1)光源

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由于熒光樣品的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光的強(qiáng)度成正比，因此，作為一種理想的激發(fā)光源應(yīng)具備：足夠的強(qiáng)度、在所需光譜范圍內(nèi)有連續(xù)的光譜、強(qiáng)度與波長無關(guān)(即光源的輸出是連續(xù)平滑等強(qiáng)度的輻射)、穩(wěn)定的光強(qiáng)。常用的光源主要有氙燈和激光器。

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(2)單色器

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熒光光譜儀中單色器一般為光柵或?yàn)V光片，需要兩個(gè)，一個(gè)用于選擇激發(fā)光波長(激發(fā)單色器)，一個(gè)用于分離選擇熒光發(fā)射波長(發(fā)射單色器)。

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(3)樣品池

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熒光光譜儀用的樣品池材料要求無熒光發(fā)射，通常為熔融石英，樣品池四壁均光潔透明。對于固體樣品，通常固定在樣品夾的表面。

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(4)檢測器

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熒光的強(qiáng)度通常比較弱，因此要求檢測器有較高的靈敏度。一般采用光電倍增管(PMT)，二極管陣列檢測器、電荷耦合裝置以及光子計(jì)數(shù)器等高功能檢測器也已得到應(yīng)用。

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2.熒光光譜儀的光譜分辨率

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光譜分辨率是指把光譜特征、譜帶分解成為分離成分的能力。分析人員需要什么樣的光譜分辨率取決于所面對的具體問題。一般，用于基本樣品識別的常規(guī)分析只需要低/中光譜分辨率。對于樣品峰位移動(dòng)或受外在環(huán)境因素影響而引起峰位移動(dòng)的表征則通常需要高分辨率，因?yàn)檫@些現(xiàn)象在熒光光譜上僅僅表現(xiàn)為非常細(xì)微的變化，在低分辨率實(shí)驗(yàn)中觀察不到。

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3.熒光光譜儀中的單光子計(jì)數(shù)技術(shù)

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單光子計(jì)數(shù)技術(shù)是利用在弱光下PMT輸出信號自然離散化的特點(diǎn)，采用放大技術(shù)和精密的脈沖幅度甄別技術(shù)以及數(shù)字計(jì)數(shù)技術(shù)，可把淹沒在北京噪聲中的熒光信號提取出來。當(dāng)熒光到達(dá)PMT的光電子陰極時(shí)，每個(gè)入射光子以一定的概率(即量子效率)使光陰極發(fā)射一個(gè)電子。這個(gè)光電子經(jīng)倍增系統(tǒng)的倍增最后在陽極回路中形成一個(gè)電流脈沖，通過負(fù)載電阻形成一個(gè)脈沖電壓，這個(gè)脈沖稱為單光子脈沖，而“單光子計(jì)數(shù)技術(shù)”可以測得低至單個(gè)不重疊的光子能量脈沖，通過精密的鑒別手段進(jìn)行工作，從而實(shí)現(xiàn)探測“單光子”級別微弱信號的目的。

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4.熒光光譜儀中的波長準(zhǔn)確度和波長重復(fù)性

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波長準(zhǔn)確度，是指波長的實(shí)際測定值與理論值(真值)的差。熒光光譜儀的波長準(zhǔn)確度是很重要的技術(shù)指標(biāo)，特別是對不同儀器的測定結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)，波長準(zhǔn)確度尤其重要。例如，要對比兩臺(tái)熒光光譜儀對同一樣品的分析測試結(jié)果，如果儀器的波長準(zhǔn)確度不好，就無法進(jìn)行比較或比較不出正確的結(jié)果。針對同一物質(zhì)，在不同波長測試同一物質(zhì)時(shí)，用于不同波長時(shí)的熒光性質(zhì)不同，就會(huì)有不同的靈敏度，即使同一樣品，測試的數(shù)據(jù)也會(huì)不同。用一臺(tái)熒光光譜儀做定量分析時(shí)，若儀器的波長準(zhǔn)確度不好，也會(huì)因儀器的波長誤差，而產(chǎn)生很大的分析誤差。波長準(zhǔn)確度對國家的計(jì)量法執(zhí)法非常重要。

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波長重復(fù)性與波長準(zhǔn)確度一樣重要。如果一臺(tái)熒光光譜儀的波長重復(fù)性不好，就等于每次分析測試時(shí)所用的波長都是不同的，不可能得到可靠的分析結(jié)果。因此，一臺(tái)儀器的波長重復(fù)性不好，就無法滿足使用要求。

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5.熒光光譜儀中的信噪比(S/N)

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熒光光譜儀中常用水的拉曼作信噪比測試，這是比較不同儀器之間靈敏度的一個(gè)好方法。雖然有很多有效的方法可以獲得信噪比數(shù)據(jù)，但是給出的數(shù)值卻不同。為了進(jìn)行對比，不僅要知道怎么測量水拉曼S/N值，還要知道怎么處理數(shù)據(jù)。

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一般水的拉曼S/N測試方法是把體系的靈敏度(信號存在)和體系噪音(信號不存在)的數(shù)據(jù)同時(shí)獲取并進(jìn)行比較，顯示了儀器的綜合性能。

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對于S/N值的處理，一種是將其定義為水拉曼峰信號和背景信號的差值和背景信號平方根的比值(Peak-Peak方式)：

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另一種是峰信號和背景信號的差值除以在背景信號上噪音的有效值(RMS信噪比方式)，有效值的取值可以是該點(diǎn)處動(dòng)態(tài)掃描測量值除以5：

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6.熒光光譜儀的靈敏度影響因素

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光源、檢測器暗電流，光譜儀設(shè)計(jì)造成的光學(xué)噪聲等因素都會(huì)影響靈敏度。

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7.熒光光譜儀的選擇

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目前，熒光光譜儀根據(jù)特定的應(yīng)用領(lǐng)域都附加有不同的特長?？梢詮撵`敏度、光譜采集速度、模塊化、自動(dòng)化、多功能性、獨(dú)特性、實(shí)際環(huán)境性能，以及升級需求等方面考慮選擇合適的熒光光譜儀。當(dāng)然，也可以聯(lián)系生產(chǎn)廠商，提出應(yīng)用需求，進(jìn)行個(gè)性化定制。

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二、熒光分析新技術(shù)

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常規(guī)的熒光分析技術(shù)主要是直接或間接對無機(jī)化合物、有機(jī)化合物等進(jìn)行定性和定量分析，因其高靈敏度和選擇性，得到了較為廣泛的應(yīng)用。然而，在實(shí)際情況中由于分析物質(zhì)的復(fù)雜性、所處環(huán)境的多樣性等，常規(guī)的熒光分析法收到了極大限制。許多新型的熒光技術(shù)，例如同步熒光分析、偏振熒光分析、三維熒光分析、時(shí)間分辨熒光分析、低溫?zé)晒夥治?、單分子熒光分析、熒光免疫分析等，得到了迅速發(fā)展，在特定的領(lǐng)域顯示出了更高的靈敏度和更強(qiáng)大的功能。下面選擇幾種進(jìn)行簡單介紹：

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1.同步熒光分析

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同步熒光分析由Lloyd首先提出，它與常用熒光測定最大的區(qū)別是同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)單色器波長，由測得的熒光強(qiáng)度信號與對應(yīng)的激發(fā)波長(或發(fā)射波長)構(gòu)成光譜圖，即同步熒光光譜。按光譜掃描方式的不同，同步熒光分析可以分為恒(固定)波長法、恒能量法、可變角法和恒基體法。同步熒光分析具有光譜簡單，譜帶窄、分辨率高、光譜重疊少等優(yōu)點(diǎn)，可提高選擇性，減少散射光等的影響，非常適合多組分混合物的分析，在環(huán)境、藥物、臨床、化工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

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圖2 某池塘水樣的恒波長同步熒光光譜

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2.偏振熒光分析

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任何物質(zhì)都處于不斷運(yùn)動(dòng)中，液體環(huán)境中的熒光分子也不例外。因此當(dāng)受到偏振光激發(fā)時(shí)，熒光分子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)(如旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn))、熒光分子與其他因子相互作用(如相互結(jié)合或排斥)、其所處環(huán)境的性質(zhì)(如溶液的黏度、溫度_等因素都可能對熒光分子受激發(fā)后發(fā)出的偏振光的性質(zhì)產(chǎn)生影響。對此進(jìn)行分析比較，就可能揭開物質(zhì)活動(dòng)的內(nèi)在規(guī)律，達(dá)到研究目的。熒光體的熒光偏振與熒光各向異性值的測定，能夠提供與熒光體在激發(fā)態(tài)壽命期間動(dòng)力學(xué)相關(guān)的信息，因此熒光偏振技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究分子間的作用，例如蛋白質(zhì)與核酸、抗原與抗體、蛋白質(zhì)與多肽的結(jié)合作用等。

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熒光偏振技術(shù)比研究蛋白質(zhì)與核酸結(jié)合的傳統(tǒng)方法具有更多優(yōu)勢(特別是不生成有害的放射性廢物)，并且檢測限更低，可達(dá)到亞納摩爾級范圍。此外，熒光偏振是真正均相的，允許實(shí)時(shí)監(jiān)測(動(dòng)力學(xué)監(jiān)測)，對濃度變化不敏感，是均相檢測形式的最佳解決方案。

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圖3 不同體積比全血溶液的熒光偏振光譜

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3.三維熒光分析

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三維熒光光譜是近幾十年中發(fā)展起來的一種新熒光技術(shù)。普通熒光分析所得的光譜是二維譜圖，包括固定激發(fā)波長而掃描發(fā)射波長所獲得的發(fā)射光譜，和固定發(fā)射波長而掃描激發(fā)波長所獲得的激發(fā)光譜。但是實(shí)際上熒光強(qiáng)度應(yīng)該是激發(fā)和發(fā)射這兩個(gè)波長變量的函數(shù)。描述熒光強(qiáng)度同時(shí)隨激發(fā)和發(fā)射波長變化的關(guān)系譜圖，就是三維熒光光譜。它可以提供比常規(guī)熒光光譜和同步熒光光譜更為完整的光譜信息，是很有價(jià)值的光譜指紋技術(shù)。在一個(gè)多組分體系的三維熒光光譜中，每種組分有獨(dú)立吸收和發(fā)射的特定光譜區(qū)，可以通過一次掃描便有可能檢測體系中的全部組分。

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三維熒光光譜可以作為光譜指紋技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測(溶解有機(jī)質(zhì)的分布等)、臨床化學(xué)(根據(jù)癌細(xì)胞熒光代謝產(chǎn)物的檢測，區(qū)分癌與非癌細(xì)胞等)以及細(xì)菌鑒別等領(lǐng)域應(yīng)用;也可用于光化學(xué)反應(yīng)監(jiān)測、多組分混合物的定性和定量分析等。

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圖4 三峽水庫中溶解有機(jī)質(zhì)的三維熒光光譜圖

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4.時(shí)間分辨熒光分析

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由于不同分子的熒光壽命不同，可在激發(fā)與檢測之間延緩一段時(shí)間，使具有不同熒光壽命的物質(zhì)得以分別檢測，即時(shí)間分辨熒光分析。采用帶時(shí)間延遲設(shè)備的脈沖光源和帶有門控時(shí)間電路的檢測器件，可以在固定延遲時(shí)間后和門控寬度內(nèi)得到時(shí)間分辨熒光光譜。選擇合適的延遲時(shí)間，可以把待測組分的熒光和其他組分或雜質(zhì)的熒光以及儀器的噪聲分開不受干擾。采用激光光源可以獲得皮秒(ps)級的脈沖寬度，可用于測定大多數(shù)熒光物質(zhì)的壽命，非常有助于生物大分子和基團(tuán)作用的研究。該技術(shù)與熒光免疫分析結(jié)合形成了時(shí)間分辨熒光免疫分析法。

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5.低溫?zé)晒夥治?/p>

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通常熒光分析都在室溫下進(jìn)行，熒光光譜為帶光譜，由于各種變寬因素，譜帶往往較寬。自然界有許多有機(jī)化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)頗為接近，而且各存在著多種同分異構(gòu)體和衍生物，它們的光譜往往相互重疊，難以鑒別表征以及定量測定。環(huán)境因素對分子熒光會(huì)產(chǎn)生顯著的影響，溫度是其中一個(gè)主要因素。隨著溫度的降低，介質(zhì)黏度增大，熒光分子量子產(chǎn)率和熒光強(qiáng)度將增大。因此，在低溫以及特殊條件下，熒光物質(zhì)就能給出尖銳的熒光光譜(“準(zhǔn)線性光譜”)，這就有可能對樣品中所含熒光體進(jìn)行“指紋識別”，甚至有可能對混合物中某些特定組分進(jìn)行定量測定。

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低溫?zé)晒夥治龇ɑ究梢苑譃樗姆N類型：冷凍溶液Shpol’skii熒光法、蒸氣相基體隔離熒光法、基體隔離Shpol’skii熒光法、有機(jī)玻璃中熒光窄線法。低溫?zé)晒夥治隹捎糜诙喹h(huán)芳烴及衍生物的鑒別與定量、DNA加合物的分析等。

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圖5 羊茅草葉綠素的常溫和液氮低溫下的熒光光譜

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6.單分子熒光檢測

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單分子檢測被稱為分析化學(xué)的極限，近年來取得了重要進(jìn)展。其中，單分子熒光分析是實(shí)現(xiàn)單分子檢測最靈敏的光分析技術(shù)。單分子熒光檢測的關(guān)鍵在于確保被照射的體積中只有一個(gè)分子與激光發(fā)生作用以及消除雜質(zhì)熒光的背景干擾。通常采用高效濾光片，利用共焦、近場合消失波激發(fā)，可以達(dá)到此目的。單分子熒光檢測可提供單分子水平上生物分子反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)信息，分子構(gòu)象以及構(gòu)象隨時(shí)間的變化，因此尤其在生命科學(xué)領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景，為生命科學(xué)提供了新的研究手段。

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7.熒光免疫分析

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免疫分析是基于蛋白抗原和抗體之間、或者小分子半抗原與抗體之間的特異反應(yīng)的分析方法，是生物分析化學(xué)的重要內(nèi)容之一。其中，用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記的免疫分析即為熒光免疫分析。作為熒光標(biāo)記物，應(yīng)具有高的熒光強(qiáng)度，其發(fā)射的熒光與背景熒光有明顯區(qū)別;它與抗原或抗體的結(jié)合不破壞其免疫活性，標(biāo)記過程要簡單、快速;水溶性好;所形成的免疫復(fù)合物耐儲(chǔ)存。常用的熒光物質(zhì)有熒光素、異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰基熒光素等。熒光免疫分析主要應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并向著超高靈敏度和操作自動(dòng)化的方向發(fā)展。

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參考文獻(xiàn)：

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