小果今天介紹單細(xì)胞測序平臺(tái)中最受歡迎的10×genomics的原理。 ?單細(xì)胞測序（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）是在單個(gè)細(xì)胞水平進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的技術(shù)。在單個(gè)細(xì)胞的分辨率下，科學(xué)家能真正的定義細(xì)胞類型特定的基因表達(dá)，分辨出細(xì)胞的異質(zhì)性。這是過去RNA-seq所無法企及的。

在眾多的單細(xì)胞測序平臺(tái)中，10×genomics最受歡迎表現(xiàn)最亮眼。其采用了基于微滴的微流體技術(shù)來分選細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了真正的單細(xì)胞測序，并且保證了超高的細(xì)胞通量與細(xì)胞捕獲效率，具有性價(jià)比高，時(shí)間周期短，不受細(xì)胞類型約束等優(yōu)點(diǎn)

其平臺(tái)提供多種產(chǎn)品，這也是其較其它公司的優(yōu)勢之一

單細(xì)胞建庫測序流程

單細(xì)胞測序的三個(gè)基本步驟。 小果會(huì)從樣本的制備開始，然后講解10×genomics文庫構(gòu)建和測序的原理及其優(yōu)勢。

單細(xì)胞樣本制備

單細(xì)胞樣本的制備有以下幾種方法。

1. Limiting?dilution極限稀釋

這一種常用的技術(shù)，手動(dòng)使用移液器通過稀釋分離單個(gè)細(xì)胞。這種方法效率比較低。

2. Micromanipulation顯微操縱術(shù)

該技術(shù)非常經(jīng)典，曾用于從早期胚胎或未培養(yǎng)的微生物中提取細(xì)胞，使用顯微鏡引導(dǎo)的毛細(xì)管移液，來從懸浮液中提取單細(xì)胞。然而，這些方法耗時(shí)且吞吐量低。

3. FACS

flow-activated cell?sorting (FACS)，使用流式細(xì)胞儀來分選細(xì)胞。首先用熒光單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞，該抗體識(shí)別特定的表面標(biāo)記，并能夠?qū)Σ煌娜后w進(jìn)行分類?；蛘撸瑢?duì)于未染色的種群，負(fù)選擇也是可能的。 但是上述三種局限性有，對(duì)起始細(xì)胞體積的要求（細(xì)胞數(shù)少于10000會(huì)難以分離細(xì)胞）以及需要對(duì)感興趣靶向蛋白質(zhì)的抗體。

4.?Laser capture microdissection激光捕獲顯微切

該技術(shù)利用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)輔助的激光系統(tǒng)從固體樣品中分離細(xì)胞。

5.?與抗體結(jié)合磁鐵篩選

該系統(tǒng)使用與抗體結(jié)合的磁鐵來檢測上皮來源的CTC（CD45-和EpCAM+）。例如，為了分離罕見的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC），CellSearch（第一個(gè)經(jīng)過臨床驗(yàn)證、美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的測試）開發(fā)了一種系統(tǒng)來枚舉患者血液樣本中的CTC（圖1f）。

6.?Microfluidic technology微流體技術(shù)

用于單細(xì)胞分離的技術(shù)由于其低樣品消耗和低分析成本以及能夠?qū)崿F(xiàn)精確的流體控制而廣受歡迎。同時(shí)，該技術(shù)所需的nL大小的體積大大降低了外部污染的風(fēng)險(xiǎn)。 該技術(shù)最初用于少量的生物化學(xué)分析，用于DNA和蛋白質(zhì)的分析?，F(xiàn)在開發(fā)出了復(fù)雜的微流陣列，允許對(duì)閥門和開關(guān)進(jìn)行單獨(dú)控制，從而提高了它們的可擴(kuò)展性。 近年來微流體技術(shù)的快速發(fā)展改變了基礎(chǔ)科學(xué)家和臨床醫(yī)生的研究能力。該技術(shù)可以以高度并行的方式對(duì)單個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)譜的量化。

幾種單細(xì)胞分選技術(shù)比較

10×?genomics?核心技術(shù)原理

10×genomics平臺(tái)應(yīng)用了先進(jìn)的微流體技術(shù)以高捕獲效率提供了單細(xì)胞RNA 3′端的高通量分析。因此，這種高通量處理方法能夠在足夠異質(zhì)的生物空間中分析稀有細(xì)胞類型。目前10×genomics已成為單細(xì)胞測序最受歡迎的平臺(tái)。 下面繼續(xù)由小果帶大家了解一下它的核心技術(shù)原理。

GEM（gel?bead inemulsion）凝膠珠乳液

每個(gè)bead上面有READ1, Barcode, UMI, Poly(dT)VN READ1 ：包含測序用的接頭adaptor, Index, 測序引物。 Barcode，每個(gè)GEM帶有唯一的Barcod條形碼，用來區(qū)分細(xì)胞，識(shí)別不同的細(xì)胞。通常有16bp，共4的16次方種變化。 UMI：特異的分子片段，用來標(biāo)記reads。用來解決pcr擴(kuò)增引入的偏差， 偏差對(duì)單細(xì)胞影響很大。 通常每個(gè)beads擁有一組不同的UMI。 Poly(dT)VN：與mRNA的PloyA尾互補(bǔ)，用來捕獲細(xì)胞內(nèi)，。

CB即cell?barcode, 不同版本CB與UMI的長度變化。 10×genomics單細(xì)胞分選

平臺(tái)的單細(xì)胞分離技術(shù)是基于微滴的微流體。它允許水滴在連續(xù)油相中單分散。 GEM會(huì)從左往右流動(dòng)，在第一個(gè)十字路口，樣本細(xì)胞會(huì)進(jìn)入和凝膠珠結(jié)合，在第二個(gè)十字路口會(huì)被油滴包裹，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的捕獲。與標(biāo)準(zhǔn)微流體室相比，該系統(tǒng)所需的細(xì)胞體積更低，能夠以更低的成本操作和篩選數(shù)千至數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞。

超高的細(xì)胞通量

①?孔加入細(xì)胞樣本，②孔加入凝膠珠，③加入油滴 每個(gè)微流孔有八條line，每個(gè)line，10000個(gè)細(xì)胞，每次 通量可達(dá)8萬。

10×genomics建庫測序流程

1.油滴凝膠珠捕獲單細(xì)胞。 2.單細(xì)胞裂解，凝膠珠上的PolyT會(huì)捕獲mRNA的PloyA尾 3.測序 4.按照barcode分類細(xì)胞 5.按照UMI去重復(fù)reads

10×?genomics測序與illumina契合度很高，與illumina平臺(tái)建庫方法差不多 1.?PolyT捕獲mRNA 2.?mRna打斷 3.?第一鏈合成 4.?第二鏈合成 5.?3’與5‘端修飾 6.?連接adapter 7.?PCR擴(kuò)增

測序

Read1:P5接頭與ilumina一樣，Read1包含接頭adaptor, Index,測序引物等從綠色的部分開始測測到UMI. 最后測16+12=28bp. Read2:從底部鏈TruSeq開始測，測91bp， read2測到的是mRNA序列信息，read1測的是barcode,UMI

10×genomic測序的結(jié)果是3‘端數(shù)據(jù)

優(yōu)勢

1.真正單細(xì)胞測序 2.超高細(xì)胞通量 3.細(xì)胞捕獲效率高 4.細(xì)胞可適性高 5.多態(tài)率低 6.時(shí)間周期短 7.性價(jià)比高

總結(jié)：

1、文庫構(gòu)建時(shí)有很多種類的GEMs 2、通過合理控制每次輸入的細(xì)胞數(shù)，來最終控制檢測的細(xì)胞數(shù);目前平局可以檢測3000-8000個(gè)細(xì)胞; 3、一般來說，約有65%的GEM在10X芯片的管道中可以成功捕獲細(xì)胞，但也有35%沒有捕獲細(xì)胞，稱為空載; 4、空載的GEM并非沒有任何結(jié)果。由于單細(xì)胞懸液中存在細(xì)胞破裂產(chǎn)生的游離RNA因此空載GEM中也會(huì)擴(kuò)增得到少量RNA的信息，但基因數(shù)會(huì)很少 5、有部分GEM中會(huì)包含兩個(gè)細(xì)胞稱為doublets，超過兩個(gè)稱為multiplets。6、最終要將空載或者過載的非單細(xì)胞過濾掉 6、和ilummina平臺(tái)關(guān)系緊密，可以收10×genomics設(shè)備用來捕獲單細(xì)胞，測序在ilumina平臺(tái)測序。 7、細(xì)胞破碎后，樣本混合在一起測序，通過barcode來識(shí)別細(xì)胞，有多少barcode就有多少細(xì)胞。每個(gè)細(xì)胞里面有多少條UMI就測了多少條reads。 8、注意用新鮮組織細(xì)胞，若細(xì)胞死亡裂解，凝膠珠會(huì)捕捉游離的RNA。 好了小果今天關(guān)于10×genomics的分享就到這里了，歡迎來和小果討論。