動物實驗AAV感染指南——神經(jīng)系統(tǒng)篇
上期我們介紹了感染肺部的常見注射方法，本期主要介紹感染神經(jīng)系統(tǒng)的常用注射方法。文字描述末尾有附上視頻教程鏈接哦，小伙伴可直接將網(wǎng)址復制到瀏覽器中觀看學習~
腦立體定位注射操作步驟[1]：
1、用70%酒精棉擦拭腦定位儀，將定位儀的保暖托盤加熱后放回，注射器吸取病毒液，隨后固定在定位儀上；
2、麻醉小鼠，剃除小鼠頭部眼睛到耳朵之間的毛發(fā)，用棉球棒蘸取碘伏進行消毒，將小鼠放到立體定位儀的保暖托盤上；
3、定位儀歸零牙齒和耳朵的標尺，將小鼠上門牙固定到固定板的槽內(nèi)，確保頭部保持固定；
4、調(diào)節(jié)bregma（前囟）和lambda（人字縫尖）在同一矢狀線上和水平面，務必確保小鼠鼻子居中、穩(wěn)定；
5、在小鼠的眼睛上涂上眼藥膏，防止眼干；
6、用手術刀劃開小鼠頭部皮膚，刮掉表面硬腦膜，并用夾子固定腦部皮膚；
注：如有血跡請用棉簽擦干，確保bregma和lambda位置清晰可見；
7、把bregma坐標歸位0（X, Y, Z=0），確保lambda位置與bregma位于同一水平面，根據(jù)目的腦區(qū)設定好坐標，一旦坐標固定，用馬克筆在顱骨做出標記；
8、在10 s內(nèi)在顱骨鉆出一個月0.015 mm的孔，鉆的過程務必小心，以防損傷腦組織；
9、根據(jù)設好的坐標進針，進針完成后以0.05-0.1μL/min的速度緩緩注射病毒液，通常一只小鼠的注射體積在0.05-2μL之間；
10、注射完畢，保持10min，然后緩慢回針，操作過程中如有血流出需要用棉簽及時吸干；
11、縫合傷口，如有必要可注射止疼藥；
12、將小鼠放回籠中，使小鼠身體足夠溫暖，以利于蘇醒。
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視頻教程：https://mp.weixin.qq.com/s/W7EK62Wq4bMilxnUdypy3g ???????
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鞘內(nèi)注射操作步驟[2]：
1、麻醉小鼠，在小鼠的眼睛上涂上眼藥膏，防止眼干；
2、靠近小鼠的尾部根部約2 cm2處的皮膚去毛，以便觀察下針部位，用蘸取70%酒精的紗布進行消毒；
3、將小鼠放到一個特殊的架子上，在小鼠下用一根15 cm離心管墊起，從而使下針部位稍微拱起；
4、hamilton注射器配30G針頭，吸入病毒液；
5、定位脊椎的L6（最突出的一個），并用個手指輕輕按壓使之平緩；
6、小心將針頭插入L5椎骨和L6椎骨的凹槽之間并注意小鼠尾部會微微上翹，著標志針頭成功插入髓鞘；
7、一旦成功插入，用手指固定針頭，緩慢注射5-10μL病毒液；
注：注射體積要適當，太小會加大實驗誤差，體積太大會增加鞘內(nèi)壓力。
8、將小鼠放回籠中，使小鼠身體足夠溫暖，以利于蘇醒。
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視頻教程：https://mp.weixin.qq.com/s/BqRiMzMpQXcEtiMPHeFV0g
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顳靜脈注射操作步驟（適用于新生小鼠）[3]：
1、將出生0.5天的新生小鼠放在冰上麻醉30-60s，注意控制時間，不要麻醉過頭，容易導致小鼠死亡；
2、將麻醉好的小鼠放置到解剖鏡下，一只手控制小鼠，另一只手注射；
3、用食指和大拇指輕撫耳朵位置前后，輕輕拉動小鼠皮膚，當皮膚拉伸的時候顳靜脈會看得足夠清晰；
注：顳靜脈會表現(xiàn)出陰影，而且超背腹運行，并進入頸靜脈。
4、如果插入位置適當會看到針尖的斜口處有血液溢出，緩緩將25-50μL病毒液注入，注入病毒液后血管會變白；
5、注射完成后保持針在血管內(nèi)多留10-15s防止回流，然后拔掉針頭，用手輕輕用力按壓片刻；
6、將小鼠放回籠中，使小鼠身體足夠溫暖，以利于蘇醒。
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眼眶后靜脈注射[4]：
1、麻醉小鼠，握住小鼠背部，將拇指放在氣管正側面，頭部皮毛攏至手掌，使小鼠眼球凸起。
2、將手腕支撐在穩(wěn)定的表面上，握住注射器，將食指放在柱塞上方。
3、對小鼠施加輕微壓力使眼睛凸出，針頭對準內(nèi)眥，斜面朝外，將針頭以45°插入眶后竇中心約5mm；
4、使用0.5ml 28G注射器緩慢注入150-200μL（新生小鼠病毒液用量約50μL）病毒液；
5、緩慢地取出針頭，確保針頭不會劃傷眼角膜。使用無菌紗布止血，并在眼睛上涂抹藥膏助其恢復。
6、將小鼠放回籠中，使小鼠身體足夠溫暖，以利于蘇醒。
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小伙伴可根據(jù)實驗對象和目的選擇合適的注射方式，表1列出了不同注射方式對應的作用區(qū)域和病毒用量供小伙伴們參考。AAV2和AAV9是感染腦部的常用血清型，但由于血腦屏障的存在，使用尾靜脈注射感染效果不佳。為此漢恒生物研發(fā)出了可穿過血腦屏障的血清型AAV-BBB、AAV-cap-B10以及可特異性感染腦部血管內(nèi)皮細胞的血清型AAV-brl、AAV-BI30。另外漢恒生物還可提供多種特異性啟動子（見表2）以感染目的細胞。更多關于神經(jīng)系統(tǒng)感染的問題歡迎咨詢漢恒生物！
表1 不同注射方式的作用區(qū)域和參考劑量
表2 神經(jīng)系統(tǒng)特異性啟動子
參考文獻：
[1] Benskey M J , Manfredsson F P .Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling[J].Springer New York, 2016.
[2]Junko Y,A E L,C M N, et al. A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model.[J]. Journal of visualized experiments : JoVE,2020(165).
[3]Gombash Lampe, Sara E., Kaspar, Brian K., Foust, Kevin D.. ?Intravenous injections in neonatal mice. Journal of visualized experiments : JoVE, 2014, (93):e52037.
[4]Gessler, Dominic J., Gessler, Dominic J., Gessler, Dominic J., Tai, Phillip W L., Tai, Phillip W L.. Intravenous Infusion of AAV for Widespread Gene Delivery to the Nervous System. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2019, 1950:143-163.
