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葉綠體的分離與熒光觀察

2022-09-27 23:37 作者:生物yes 0人讀過 | 我要投稿

一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、通過植物細(xì)胞葉綠體的分離，了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法。

2、觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。

二．實(shí)驗(yàn)原理

葉綠體是植物細(xì)胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞器，光合作用就是在葉綠體中進(jìn)行的。由于具有這一重要功能，所以它一直是細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的重要研究對(duì)象。葉綠體是植物細(xì)胞中較大的一種細(xì)胞器，利用低速離心即可分離集中進(jìn)行各種研究。

將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方法。一個(gè)顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時(shí)間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時(shí)間，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分。沉降順序?yàn)椋杭?xì)胞核、線粒體、溶酶體與過氧化氫酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體、核蛋白體。

葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液(0.35 mol／L氯化鈉或0.4 mol／L蔗糖溶液)中進(jìn)行．以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。將勻漿液在1000 r／min的條件下離心2min，以去除其中的組織殘?jiān)鸵恍┪幢黄扑榈耐暾?xì)胞。然后，在3000 r／min的條件下離心5min，即可獲得沉淀的葉綠體（混有部分細(xì)胞核）。分離過程最好在0～5℃的條件下進(jìn)行；如果在室溫下，要迅速分離和觀察。

熒光顯微術(shù)是利用熒光顯微鏡對(duì)可發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行觀測的一種技術(shù)。某些物質(zhì)在一定短波長的光(如紫外光)的照射下吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，就能在極短的時(shí)間內(nèi)放射出比照射光波長更長的光(如可見光)，這種光就稱為熒光。若停止供能熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后可直接發(fā)出熒光，稱為自發(fā)熒光(或直接熒光)，如葉綠素的火紅色熒光和木質(zhì)素的黃色熒光等。有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光．這種熒光稱為次生熒光(或間接熒光)，如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)桔紅色熒光。

利用熒光顯微鏡對(duì)可發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行檢測時(shí)，將受到許多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等。因此在熒光觀察時(shí)應(yīng)抓緊時(shí)間．有必要時(shí)立即拍照。另外，在制作熒光顯微標(biāo)本時(shí)最好使用無熒光載片、蓋片和無熒光油。

三．實(shí)驗(yàn)儀器

1、器材：普通離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、粗天平、熒光顯微鏡、500ml燒杯2個(gè)，250ml量筒1個(gè)，滴管10支，10ml刻度離心管20支，紗布若干，無熒光載片和蓋片各4片。

2、材料：新鮮菠菜。

3、試劑：0.35 mol／L氯化鈉溶液，0.01％吖啶橙(acridine orange)。

四．實(shí) 驗(yàn) 方法

1．選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗及粗脈，稱30g于150ml 0.35 mol／L NaCI溶液中，裝入組織搗碎機(jī)。

2．利用組織搗碎機(jī)低速(5 000 r／min)勻漿3~5min。

3．將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中。

4．取濾液4ml在1000 r／min下離心2 min。棄去沉淀。

5．將上清液在3000 r／min下離心5min，棄去上清液，沉淀即為p為葉綠體(混有部分細(xì)胞核)。

6．將沉淀用0.35 mol／L NaCl溶液懸浮。

7．取葉綠體懸液一滴滴于載片上，加蓋片后即可在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察： ①在普通光鏡下觀察；②在熒光顯微鏡下觀察； ③取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載片上，再滴加一滴0．01％吖啶橙熒光染料，加無熒光蓋片后即可在熒光顯微鏡下觀察。