寫在前面

????????今天推薦的是由天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系在2018年7月24日發(fā)表于Journal of Clinical Investigation（IF：12.466，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Lei Shi教授，研究表明泛素特異性蛋白酶7（USP7）維持DNA損傷反應(yīng)并促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生。

研究背景

????????DNA雙鏈斷裂（DSB）的識別、信號傳遞和修復(fù)的核心是MRE11-RAD50-NBS1（MRN）復(fù)合物和DNA損傷檢查點(diǎn)蛋白1（MDC1）的介體，它們的相互作用對DNA損傷反應(yīng)（DDR）的啟動(dòng)和放大至關(guān)重要。調(diào)控這一分子機(jī)制功能的內(nèi)在規(guī)則仍有待研究。

摘要部分

????????泛素特異性蛋白酶USP7與MRN-MDC1復(fù)合物有物理聯(lián)系，MRN-MDC1復(fù)合物作為USP7的平臺，有效地去泛素化和穩(wěn)定MDC1，從而維持了DDR。因此，USP7的耗盡損害了MRN-MDC1復(fù)合物的參與以及隨之而來的下游因子p53結(jié)合蛋白1（53BP1）和乳腺癌蛋白1（BRCA1）在DNA病變處的招募。值得注意的是，USP7在宮頸癌中過度表達(dá)，其表達(dá)水平與MDC1的表達(dá)水平和宮頸癌患者的生存率呈正相關(guān)。作者證明，USP7介導(dǎo)的MDC1穩(wěn)定化促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的存活，并賦予細(xì)胞對遺傳毒性損傷的抵抗力?？傊?，作者的研究揭示了USP7在調(diào)控MRN-MDC1復(fù)合物功能方面的作用。

研究內(nèi)容

1.USP7與MRN-MDC1復(fù)合物有直接的物理聯(lián)系? ? ?

????????作者首先使用親和純化和質(zhì)譜法來探究MRE11、NBS1和MDC1在體內(nèi)的相互作用。有趣的是，結(jié)果表明，泛素特異性蛋白酶USP7和其他蛋白一樣，與MRN-MDC1復(fù)合物的這3個(gè)成分中的每一個(gè)都有效地共存。? ? ?

????????為了進(jìn)一步驗(yàn)證USP7和MRN-MDC1復(fù)合物之間的體內(nèi)相互作用，作者使用Superose 6柱和尺寸排除法，通過快速蛋白液相色譜（FPLC）進(jìn)行蛋白質(zhì)分餾實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，來自HeLa細(xì)胞的原生USP7的表觀分子質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單體蛋白的表觀分子質(zhì)量，作者在第17至21餾分中檢測到USP7與MRN-MDC1復(fù)合物共存的一個(gè)大分子質(zhì)量峰。隨后通過點(diǎn)突蛋白或者標(biāo)記蛋白進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)等，從不同角度證明了USP7和MRN-MDC1復(fù)合物之間的相互作用。

研究結(jié)論：USP7通過不同的分子表面與MRN-MDC1復(fù)合物直接互動(dòng)。

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2.USP7以MRN-MDC1依賴的方式被招募到損傷部位??? ?

????????USP7與MRN-MDC1復(fù)合物的物理聯(lián)系意味著USP7在細(xì)胞對DNA損傷的反應(yīng)中的作用。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者首先調(diào)查了USP7是否被招募到DSB上，通過在不同刺激下對共聚焦顯微鏡和活細(xì)胞成像分析顯示，結(jié)果表明，USP7在DNA損傷后被動(dòng)員并被招募到DSB位點(diǎn)。? ??

????????為了研究USP7是否通過與MRN-MDC1復(fù)合物的聯(lián)系參與DSB，用對照的siRNA或針對MRE11、RAD50、NBS1或MDC1的siRNA轉(zhuǎn)染了HeLa細(xì)胞。顯微鏡分析顯示，在缺乏MRN-MDC1復(fù)合體各組成部分的細(xì)胞中，DNA損傷誘導(dǎo)的USP7的招募嚴(yán)重受損，而USP7的表達(dá)基本上沒有變化，表明USP7是以MRN-MDC1復(fù)合體依賴的方式被招募到DNA損傷部位。

研究結(jié)論：USP7對DNA損傷的招募是通過其與MRN-MDC1復(fù)合物的相互作用發(fā)生的。

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3.USP7在功能上與MDC1的穩(wěn)定性有關(guān)??? ?

????????為了探索USP7和MRN-MDC1復(fù)合物的物理相互作用和空間共定位的功能意義，作者首先檢查了USP7對MRN-MDC1復(fù)合物成分表達(dá)的影響。Western blot分析表明，敲除USP7導(dǎo)致MDC1蛋白水平明顯下降，同時(shí)，MDC1 mRNA的表達(dá)沒有受到影響。不僅如此，作者發(fā)現(xiàn)USP7的敲除與MDC1半衰期的降低有關(guān)。此外，作者發(fā)現(xiàn)，與USP7敲除相關(guān)的MDC1蛋白水平的降低可能是蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解的結(jié)果，因?yàn)檫@種影響可以被蛋白酶體特異性抑制劑MG132有效阻斷。? ? ?

????????另一方面，敲除NBS1不僅損害了USP7與MDC1的結(jié)合，而且還導(dǎo)致MDC1蛋白水平的明顯下降，這表明MRNMDC1復(fù)合物的完整性是USP7促進(jìn)MDC1穩(wěn)定的必要條件并且這種下降可以通過回補(bǔ)全長的USP7恢復(fù)，而MATH結(jié)構(gòu)域刪除（USP7/ΔMATH）的USP7則沒有回補(bǔ)效果。

研究結(jié)論：USP7與MRN復(fù)合物，特別是與NBS1的聯(lián)系在功能上與控制MDC1的穩(wěn)定性有關(guān)。

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4.USP7使MDC1去泛素化??? ?

????????為了確定USP7促進(jìn)的MDC1穩(wěn)定是否依賴于USP7的酶活性，作者建立了多西環(huán)素誘導(dǎo)（Dox-inducible）表達(dá)WT USP7（USP7/ WT）和USP7的催化無活性突變體（USP7/C223S）的HeLa。Western Blot分析表明，在USP7敲除的條件下，MDC1的下調(diào)可以通過強(qiáng)制表達(dá)USP7/WT得到恢復(fù)。? ? ?

????????作者接下來探究USP7是否具有使MDC1去泛素化的功能。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除USP7或使用USP7的抑制劑導(dǎo)致泛素化的MDC1水平增加。此外，通過IP實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)泛素化的MDC1水平在USP7/WT表達(dá)的細(xì)胞中有所下降，但在USP7/C223S表達(dá)的細(xì)胞中沒有下降。? ? ?

????????另一方面，作者進(jìn)行體外去泛素化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)USP7/WT能夠去泛素化MDC1，而USP7/C223S則不能。但是由于依賴磷酸化的MRN-MDC1復(fù)合物的組裝很難重組，從而阻礙了進(jìn)一步的研究。

研究結(jié)論：USP7針對MDC1進(jìn)行去泛素化，而且MDC1是去泛素化酶USP7的真正底物。

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5.USP7促進(jìn)的MDC1穩(wěn)定化被DNA損傷所增強(qiáng)? ? ?

????????由于MDC1是感知和修復(fù)DSBs的重要角色，作者對基因毒性損傷是否會對USP7促進(jìn)的MDC1的穩(wěn)定進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞暴露于DNA損傷時(shí)，MDC1的豐度受USP7的調(diào)節(jié)。并且USP7和MRN-MDC1復(fù)合物之間的物理聯(lián)系因DNA損傷而增強(qiáng)。? ? ?

????????接下來，作者測試了USP7是否在DNA損傷時(shí)起到去除MDC1聚泛素化鏈的作用。通過IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IR暴露導(dǎo)致多泛素化MDC1物種的水平下降，這種效果在USP7敲除后受到影響，而在USP7過表達(dá)后得到加強(qiáng)。

研究結(jié)論：USP7和MDC1之間的物理互動(dòng)和功能聯(lián)系因DNA損傷而加強(qiáng)。

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6.MDC1是USP7調(diào)節(jié)的DDR中的一個(gè)重要媒介? ? ?

????????為了進(jìn)一步支持USP7促進(jìn)MDC1穩(wěn)定的功能意義，作者接下來研究USP7是否能影響MRN-MDC1復(fù)合物在斷裂區(qū)的招募。4-OHT驅(qū)動(dòng)的AsiSI內(nèi)切酶實(shí)驗(yàn)表明， USP7的缺乏導(dǎo)致MDC1病灶在DSB位點(diǎn)的形成急劇喪失。同時(shí)，顯微鏡和活細(xì)胞成像分析表明，USP7缺失導(dǎo)致GFP標(biāo)記的MRE11、RAD50或NBS1在DSB位點(diǎn)的招募受損，其影響可通過MDC1過量表達(dá)而基本逆轉(zhuǎn)。? ? ?

????????USP7促進(jìn)的MDC1穩(wěn)定是MRN-MDC1復(fù)合物有效積累的必要條件，因此也是細(xì)胞對DNA損傷的反應(yīng)。作者研究了USP7對BRCA1和53BP1病灶形成的影響，這兩個(gè)病灶在MRN-MDC1復(fù)合物的下游起作用，在DDR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。與MRN-MDC1復(fù)合物在USP7缺失的細(xì)胞中積累的障礙相一致，BRCA1或53BP1病灶的數(shù)量在USP7敲除后急劇下降，其效果可以通過MDC1的過表達(dá)得到很大的逆轉(zhuǎn)。

研究結(jié)論：MDC1是USP7調(diào)節(jié)的DDR過程中的一個(gè)重要媒介。

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7.USP7與宮頸癌的發(fā)生和病人的生存有關(guān)? ? ?

????????鑒于DDR失調(diào)參與促進(jìn)腫瘤發(fā)生的觀察，以及USP7在多種惡性腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展中的影響，作者推測USP7促進(jìn)的MDC1穩(wěn)定在腫瘤發(fā)生中起作用。為此，作者首先分析了人類組織中的USP7和MDC1蛋白水平，IHC染色顯示，在來自卵巢和宮頸的癌細(xì)胞中，3個(gè)配對樣本中至少有2個(gè)出現(xiàn)了USP7和MDC1的上調(diào)。作者接下來進(jìn)行IHC染色，分析來自不同等級的宮頸癌和腫瘤鄰近區(qū)域的組織學(xué)正常宮頸組織的USP7和MDC1的表達(dá)情況。染色的定量分析顯示，USP7和MDC1在宮頸癌樣本中高度表達(dá)，其表達(dá)水平與宮頸癌的組織學(xué)等級相互正相關(guān)。此外，對綜合癌癥芯片數(shù)據(jù)庫Oncomine的分析顯示，USP7 mRNA水平在宮頸癌樣本中明顯上調(diào)，對The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)集的拷貝數(shù)變異（CNV）分析顯示，USP7在宮頸癌中被擴(kuò)增。重要的是，TCGA數(shù)據(jù)集的Kaplan-Meier生存分析表明，無論是USP7表達(dá)升高還是拷貝數(shù)增加，都與宮頸癌患者的不良生存率呈正相關(guān)。

研究結(jié)論：USP7在宮頸癌中具有促進(jìn)腫瘤的作用。

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8.USP7通過穩(wěn)定MDC1促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生? ? ?

????????為了檢驗(yàn)USP7促進(jìn)的MDC1穩(wěn)定化是否與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)，作者通過特定的shRNAs開發(fā)了穩(wěn)定敲除USP7的宮頸癌細(xì)胞。菌落形成實(shí)驗(yàn)顯示，敲除USP7嚴(yán)重阻礙了HeLa細(xì)胞（宮頸腺癌）的菌落形成，而MDC1的過度表達(dá)可以抵消USP7敲除所誘發(fā)的生長缺陷。將這些細(xì)胞進(jìn)一步暴露在不同劑量的X射線產(chǎn)生的IR下，發(fā)現(xiàn)USP7被敲除的細(xì)胞更容易受到IR的影響，這可以被MDC1的過表達(dá)所抵消。? ? ?

????????為了進(jìn)一步確定USP7促進(jìn)的MDC1穩(wěn)定化在宮頸癌發(fā)生和腫瘤對DNA損傷的敏感性中的作用，作者進(jìn)行了小鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在接受USP7敲除的腫瘤移植的無胸腺小鼠中，腫瘤的生長被大大抑制，而MDC1的過表達(dá)可以在一定程度上緩解USP7缺失相關(guān)的生長抑制。值得注意的是，USP7的敲除導(dǎo)致腫瘤對IR暴露的敏感性增加，而MDC1的過表達(dá)在很大程度上緩解了這種影響。對收獲的腫瘤進(jìn)行的Western blotting和IHC分析表明，USP7耗盡的腫瘤中MDC1的水平明顯下降。

研究結(jié)論：USP7促進(jìn)的MDC1穩(wěn)定保護(hù)宮頸腫瘤細(xì)胞免受基因毒性的傷害而這又有助于宮頸腫瘤的存活，并最終導(dǎo)致宮頸腫瘤的發(fā)生。

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結(jié)論與討論

????????在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)去泛素酶蛋白USP7是早期DDR的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，并揭示了它在調(diào)節(jié)損傷部位的MRN-MDC1復(fù)合物的組裝中發(fā)揮了重要作用。作者表明, USP7與MRN-MDC1復(fù)合物發(fā)生物理相互作用，導(dǎo)致MDC1的穩(wěn)定和MRN-MDC1復(fù)合物的積累，并招募53BP1和BRCA1到DSBs。作者發(fā)現(xiàn)，USP7在宮頸癌細(xì)胞中被擴(kuò)增，在臨床腫瘤樣本中，USP7的豐度與MDC1的豐度呈正相關(guān)，并與宮頸癌患者的生存率成反比，指出USP7和MDC1是宮頸癌治療的潛在目標(biāo)。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.jci.org/articles/view/120518

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