各位老師大家好！新一期10×單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組常見Q&A又來(lái)了！上一期中，我們介紹了單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)開展前最需要了解的幾大問(wèn)題。這一期，我們將為大家介紹單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中的質(zhì)控細(xì)節(jié)。

?

1.??? transcriptional bursting

首先，給大家介紹轉(zhuǎn)錄表達(dá)中的一個(gè)現(xiàn)象：轉(zhuǎn)錄爆發(fā)（Transcriptional bursting），是指基因會(huì)從沉默的狀態(tài)突然切換為激活態(tài)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄、并在短時(shí)間內(nèi)（通常不超過(guò)2-3min）急劇生成產(chǎn)生大量RNA；然后再次進(jìn)入沉默的狀態(tài)。

我們都知道，基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)是有周期性的。當(dāng)基因的轉(zhuǎn)錄被激活時(shí)，mRNA的水平會(huì)突然上升，然后慢慢下降，而相應(yīng)的蛋白水平的變化會(huì)有一定的滯后。這種周期的頻率，以及每次波動(dòng)的大小，在RNA分析中都會(huì)影響最終的表達(dá)量（可以是FPKM值、RPKM值）。這種周期性的轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，就是同transcriptional bursting有關(guān)。

?

2.??? 單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程

在bulk RNA測(cè)序過(guò)程中，由于RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增流程，會(huì)存在偏好性的問(wèn)題。同樣的，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)中也存在偏好性，如擴(kuò)增、Drop-out rates（有部分高表達(dá)的mRNA 無(wú)法被擴(kuò)增出來(lái)）、Transcriptional bursting、背景噪音、細(xì)胞周期與細(xì)胞大小、以及批次效應(yīng)帶來(lái)的偏好性。

單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程如下圖，接下來(lái)給大家詳細(xì)講解一下哪些實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)會(huì)帶來(lái)偏好性，以及如何發(fā)現(xiàn)和質(zhì)控。

?

2.1?細(xì)胞分離

我們?cè)谧鰡渭?xì)胞測(cè)序的時(shí)候，首先要做細(xì)胞分離。細(xì)胞分離必須要在較短時(shí)間內(nèi)完成，否則會(huì)影響到細(xì)胞的狀態(tài)，甚至可能導(dǎo)致RNA從細(xì)胞中漏出。

從組織中分離出單細(xì)胞可能遇到的問(wèn)題：

2? 細(xì)胞分離的不徹底，存在多個(gè)細(xì)胞黏連到一起的情況；

2? 細(xì)胞分離條件對(duì)所有細(xì)胞類型不適中，會(huì)對(duì)一些細(xì)胞造成損傷，使RNA溢出；

2? 溢出的RNA，導(dǎo)致了背景信號(hào)；

?細(xì)胞分離過(guò)程可能會(huì)產(chǎn)生偏好性。例如分離出的細(xì)胞可能只是一些特定細(xì)胞。因此對(duì)于聚類的結(jié)果，要進(jìn)行仔細(xì)檢查，以發(fā)現(xiàn)某一群細(xì)胞中特異表達(dá)的基因是否存在著會(huì)由細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)所引起的高表達(dá)基因。中科有著專業(yè)的實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)，可以選擇最優(yōu)的細(xì)胞分離方案，在保證細(xì)胞活率大于80%的同時(shí)，降低偏好性的影響。

?

2.2?細(xì)胞分選

在做細(xì)胞分選的過(guò)程中會(huì)遇到如下的問(wèn)題：

2? 現(xiàn)有的單細(xì)胞測(cè)序都會(huì)遇到有些drople可能是空的或者存在多個(gè)細(xì)胞；

2? 對(duì)于細(xì)胞的類型也往往存在偏好性，如中性粒細(xì)胞等；

2? 分選實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)損害細(xì)胞，造成背景噪音；

因此，選擇合適的單細(xì)胞測(cè)序策略尤為重要。Chromium X相較之前的型號(hào)，額外增加了溫控系統(tǒng)，可以使整個(gè)系統(tǒng)始終在恒定條件下運(yùn)行，降低批次效應(yīng)，提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。通過(guò)微流控系統(tǒng)將單個(gè)細(xì)胞與Gel Beads結(jié)合形成GEMs，細(xì)胞捕獲率65%，雙細(xì)胞捕獲率為0.4%/1000個(gè)細(xì)胞，上機(jī)一次運(yùn)行的時(shí)間不超過(guò)18min。

2.3?細(xì)胞裂解

在做單細(xì)胞測(cè)序之前，需要對(duì)GEMs中細(xì)胞進(jìn)行裂解。不同的細(xì)胞組織，裂解條件也會(huì)不一樣，如果裂解條件過(guò)于嚴(yán)格，就會(huì)影響文庫(kù)制備。中科單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)會(huì)根據(jù)不同細(xì)胞類型選擇合適的裂解條件，確保后續(xù)文庫(kù)制備正常。

?

2.4?反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增

在GEMs中細(xì)胞裂解后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄（RT），形成10×Bacoded cDNA，

再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，質(zhì)控要求cDNA總量＞100ng（濃度＞2.22ng/μl），片段分布在500bp-3000bp。由于不同細(xì)胞的擴(kuò)增條件是不同的，但是在單細(xì)胞在擴(kuò)增時(shí)的擴(kuò)增條件單一，必然就會(huì)使得不同細(xì)胞的擴(kuò)增效率存在不同，此外，PCR本身循環(huán)擴(kuò)增過(guò)程中也會(huì)存在bias。但得益于Gel Beads中的UMI（對(duì)基因絕對(duì)定量），無(wú)論基因被擴(kuò)增多少次，只對(duì)UMI計(jì)數(shù)一次，這消除了PCR擴(kuò)增帶來(lái)的偏好性。

2.5?文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

對(duì)構(gòu)建好的單細(xì)胞文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，文庫(kù)濃度一般比cDNA濃度高出10倍以上。片段分布在300-600bp，主峰落在450bp左右。最后將質(zhì)檢合格的文庫(kù)上機(jī)測(cè)序，整個(gè)單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)到此就結(jié)束了！

總結(jié)

相信大家閱讀完以上內(nèi)容，已經(jīng)對(duì)單細(xì)胞測(cè)序整體實(shí)驗(yàn)流程的質(zhì)控細(xì)節(jié)有一定了解了。下一期會(huì)給大家?guī)?lái)分析環(huán)節(jié)的質(zhì)控內(nèi)容，敬請(qǐng)期待！