前言

2022年10月25日，魯南制藥聯(lián)合山東大學(xué)在 Frontiers in Immunology期刊發(fā)表的題為 “The anti-aging effects of Renshen Guben on? thyrotoxicosis? mice:? Improving? immunosenescence, hypoproteinemia, lipotoxicity, and intestinal flora”的研究成果，魯南制藥集團(tuán)馮芹博士為第一作者，魯南制藥集團(tuán)張貴民研究員和山東大學(xué)齊魯醫(yī)院劉德山教授為共同通訊作者。研究采用流式細(xì)胞技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)，糞便代謝物學(xué)、植物代謝組學(xué)和微生物組學(xué)等研究方法，研究人參固本（RSGB）口服液對甲狀腺毒癥加速衰老小鼠模型的影響。

結(jié)果表明，RSGB恢復(fù)了中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)了淋巴細(xì)胞的功能，提高了補(bǔ)體和抗菌肽的水平，表明RSGB在細(xì)胞和分子水平上提高了甲狀腺毒癥小鼠的免疫力。RSGB 通過改善貧血、低白蛋白血癥、離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和維生素結(jié)合蛋白來糾正甲狀腺毒癥小鼠的營養(yǎng)不良。

RSGB通過提高膽汁酸和腸道乳酸菌水平增強(qiáng)了甲狀腺毒癥小鼠的腸道防御能力。植物代謝組學(xué)分析表明，RSGB口服液和含藥血清中含有多種活性成分，包括萜類、酚酸、黃酮類、單寧、生物堿、有機(jī)酸、酚胺、氨基酸等，它們具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗衰老作用，是RSGB的物質(zhì)基礎(chǔ)。

總體而言，RSGB 通過改善免疫衰老、低蛋白血癥、脂毒性和腸道菌群對抗甲狀腺毒癥小鼠的加速衰老，本研究表明RSGB系統(tǒng)的抗衰老作用將有利于改善老年人的疾病易感性和預(yù)后。

中文標(biāo)題：人參固本對甲狀腺素毒癥小鼠的抗衰老作用：改善免疫衰老、低蛋白血癥、脂毒性和腸道菌群

研究對象：小鼠

發(fā)表期刊：Frontiers in Immunology

影響因子：8.786

發(fā)表時(shí)間：2022年10月25日

合作單位：魯南制藥集團(tuán)，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院

運(yùn)用組學(xué)技術(shù)：流式細(xì)胞技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)，糞便代謝物學(xué)、植物代謝組學(xué)和微生物組學(xué)，蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)

研究背景

老齡化問題的核心是疾病易感性和預(yù)后不良的增加，而復(fù)雜的藥物治療也會(huì)增加這種風(fēng)險(xiǎn)。因此，維護(hù)自我恢復(fù)能力是保護(hù)老年人的有效科學(xué)策略。循環(huán)系統(tǒng)中有各種細(xì)胞、蛋白質(zhì)和代謝物，對維持機(jī)體正常的生理功能具有重要意義。免疫細(xì)胞和免疫分子水平的減少反映了機(jī)體儲(chǔ)備功能的下降，這是導(dǎo)致老年人對疾病的抵抗力下降的原因。低蛋白血癥會(huì)導(dǎo)致代謝廢物的運(yùn)輸和清除受損，代謝廢物積聚產(chǎn)生的毒性如脂毒性會(huì)導(dǎo)致衰老。而腸道菌群的失衡也會(huì)導(dǎo)致許多與年齡相關(guān)的退行性疾病和不健康的衰老。

人參固本口服液（RSGB）是著名的經(jīng)典方劑，具有強(qiáng)身健體、恢復(fù)元?dú)獾淖饔谩Ｈ藚⒐瘫究诜禾幏桨ㄈ藚?、生地黃、熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓、麥冬、天冬，這些中藥由于其經(jīng)久不衰的使用和眾所周知的功效被列入中國藥典，其藥理作用，尤其是抗衰老作用，已被廣泛研究，他們的聯(lián)合處方RSGB將具有超強(qiáng)的抗衰老作用。

雖然根據(jù)中醫(yī)理論，RSGB在臨床上有廣泛的應(yīng)用，但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論中的作用機(jī)制和有效成分仍不清楚。作者前期的研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺毒癥小鼠模型具有免疫衰老、營養(yǎng)不良、脂毒性等特點(diǎn)，可被認(rèn)定為抗衰老藥物篩選的加速衰老模型。本文采用甲狀腺素毒癥加速衰老小鼠模型從免疫、營養(yǎng)、代謝和腸道菌群等方面研究了RSGB口服液對甲狀腺毒癥小鼠的抗衰老作用。本研究將血常規(guī)、生化、流式細(xì)胞儀、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、微生物組學(xué)和植物代謝組學(xué)相結(jié)合，闡明RSGB的作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)。

研究思路

研究結(jié)果

1.RSGB 逆轉(zhuǎn)甲狀腺毒癥小鼠粒細(xì)胞缺乏癥

血常規(guī)檢測結(jié)果顯示，給與過量甲狀腺素10天后，白細(xì)胞（WBC）、中性粒細(xì)胞（NEUT）和淋巴細(xì)胞（LYMPH）明顯減少。高劑量的 RSGB增加了甲狀腺毒癥小鼠的 WBC，而低中高劑量（5,10, 20 ml·kg ?每天1次，連續(xù)20天）的 RSGB均增加了NEUT（圖 1A），這表明 RSGB 可以逆轉(zhuǎn)甲狀腺毒癥小鼠的粒細(xì)胞缺乏癥。

2.RSGB 減輕甲狀腺毒癥小鼠白細(xì)胞減少和貧血

血常規(guī)檢測結(jié)果顯示，給與過量甲狀腺素20天后，全血細(xì)胞明顯減少。血常規(guī)檢測結(jié)果顯示，RSGB治療（5ml·kg?每天2次，連續(xù)30天）使甲狀腺毒癥小鼠的降低的WBC、NEUT、LYMPH和嗜酸性粒細(xì)胞均顯著升高（圖1B），這表明RSGB逆轉(zhuǎn)了白細(xì)胞減少。RSGB 治療組的紅細(xì)胞 (RBC)、血紅蛋白 (HGB)、血細(xì)胞比容 (HCT) 和 RDW-SD 也增加（圖 1C），這表明 RSGB 減輕了甲狀腺毒癥小鼠的貧血。RSGB 治療組的血小板計(jì)數(shù) (PLT) 也增加（圖 1D），這表明 RSGB 可以預(yù)防甲狀腺毒癥小鼠的血小板減少癥。盡管 RSGB 處理的小鼠和甲狀腺毒癥小鼠之間的網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)有增加趨勢（圖 1E），而且RSGB治療組低熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞增加，而高熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞減少，未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞分?jǐn)?shù)降低，表明RSGB治療通過促進(jìn)了甲狀腺毒癥小鼠紅細(xì)胞成熟而減輕貧血（圖 1F）。

3.RSGB 改善甲狀腺毒癥小鼠低蛋白血癥

生化檢測顯示，RSGB治療組總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）和球蛋白(GLB)水平顯著升高，表明RSGB治療改善了甲狀腺毒癥小鼠的低蛋白血癥和低白蛋白血癥（圖1G）。

4.RSGB增強(qiáng)甲狀腺毒癥小鼠淋巴細(xì)胞功能

流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明，RSGB 治療顯著增加了甲狀腺毒癥小鼠中 CD4/CD8 的比率和 CD3CD4 IFN- γ 的百分比（圖1H）。說明RSGB改善了免疫衰老，恢復(fù)了淋巴細(xì)胞的功能。

圖1?|? 人參固本（RSGB）對甲狀腺毒癥小鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞亞群和功能、生化指標(biāo)的影響

a)RSGB處理(5、10和20ml·kg?，每天一次，20天)顯著增加了中性粒細(xì)胞。

b)RSGB處理(5ml·kg?，每天兩次，30天)顯著增加了甲狀腺毒癥小鼠的白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。

c)RSGB 治療恢復(fù)了紅細(xì)胞 (RBC)、血紅蛋白、血細(xì)胞比容和 RDW-SD，這表明 RSGB 可以改善甲狀腺毒癥小鼠的貧血。?

d)RSGB 治療增加了血小板計(jì)數(shù)。

e)網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)表明，RSGB 治療促進(jìn)了甲狀腺毒癥小鼠的紅細(xì)胞成熟。

f)網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)表明，RSGB 治療減輕了貧血。

g) RSGB 治療顯著增加了甲狀腺毒癥小鼠的總蛋白、白蛋白和球蛋白水平，這表明 RSGB 治療改善了甲狀腺毒癥小鼠的低蛋白血癥。

h) RSGB 治療增加了 CD4+/CD8+ 的比例和 CD3+CD4+ IFN- Γ + 的百分比，這表明 RSGB 改善了甲狀腺毒癥小鼠的免疫衰老。

5.血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析

主成分分析顯示，甲狀腺毒癥小鼠（V）和RSGB治療小鼠（L）之間存在顯著差異，蛋白質(zhì)組學(xué)分析突出了兩組之間的36個(gè)DEP。兩種下調(diào)的蛋白質(zhì)是 Cycs 和 Apoc3。通過 Metascape 在線分析了 34 種上調(diào)的蛋白質(zhì)并進(jìn)行通路富集（圖2B）。

STRING 顯示上調(diào) DEP 的詳細(xì)信息（圖2C）。在這些上調(diào)的蛋白質(zhì)中，12 個(gè)與防御反應(yīng)有關(guān)，10 個(gè)與免疫反應(yīng)有關(guān)，3 個(gè)為抗菌肽，這表明 RSGB 處理增加了防御能力。

相關(guān)性分析表明，下調(diào)的 DEPs Apoc3 和 Cycs 與大多數(shù)上調(diào)的 DEPs 呈負(fù)相關(guān)。Alb 與大多數(shù)上調(diào)的 DEP 呈正相關(guān)（圖2D）。表明RSGB治療顯著改善了甲狀腺毒癥小鼠的低白蛋白血癥。綜上所述，血清蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，RSGB 治療顯著改善了甲狀腺毒癥小鼠的防御能力和營養(yǎng)不良。

圖2 |?人參固本（RSGB）對甲狀腺毒癥小鼠血清蛋白質(zhì)組的影響

a)甲狀腺毒癥小鼠 (V) 和 RSGB 治療小鼠 (L) 之間有 36 種差異表達(dá)蛋白 (DEP)：2 種下調(diào)，34 種上調(diào)。

b)Metascape 在線分析共分析了 34 種上調(diào)的蛋白質(zhì)。

c)STRING 在線分析 ( https://string-db.org/ ) 顯示了上調(diào)的 DEP 集群。

d)DEP 的相關(guān)性分析。紅色為正相關(guān)，藍(lán)色為負(fù)相關(guān)。

6.血清和糞便中的 LC-MS 代謝組學(xué)分析

血清代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示，RSGB治療組（L）和甲狀腺毒癥組（V）的OPLS-DA評分存在顯著差異（圖3A）。熱圖顯示了一些 DEM 的豐度（圖 3B）?；?Lipidmaps (v2.3) 數(shù)據(jù)庫，篩選了 RSGB 治療小鼠血清中的 163 個(gè)脂質(zhì) DEP（圖 2B）。

糞便代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示，RSGB治療組（L）和甲狀腺毒癥組（V）的OPLS-DA評分存在顯著差異（圖3D）。在 RSGB 處理的小鼠的糞便中，膽汁酸類顯著上調(diào)（圖 3E）。(膽汁酸、氨基酸和蛋白質(zhì)合成代謝示意圖見圖3F)

圖3 |? 人參固本（RSGB）對甲狀腺毒癥小鼠血清和糞便代謝組的影響

a)血清代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示，RSGB 治療組 (L) 和溶媒對照組 (V) 的 OPLS-DA 評分存在顯著差異。

b)熱圖顯示，在 RSGB 治療組中，氨基酸、肽和類似物類別中的血清差異表達(dá)蛋白 (DEP) 被下調(diào)。

c)熱圖顯示血清中脂質(zhì)組學(xué)的結(jié)果，脂毒性代謝產(chǎn)物顯著下調(diào)，保護(hù)性脂類DPA和膽汁酸水平顯著上調(diào)。

d)糞便代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示，RSGB 治療組 (L) 和溶媒對照組 (V) 的 OPLS-DA 評分存在顯著差異。

e)糞便代謝組學(xué)表明糞便中的氨基酸二肽顯著下降，膽汁酸水平顯著升高。

f)膽汁酸、氨基酸和蛋白質(zhì)合成代謝示意圖，膽汁酸合成和腸道轉(zhuǎn)化增加，蛋白合成增加，氨基酸、二肽的丟失減少。

7. 糞便中微生物組變化及其與RSGB代謝物的相關(guān)性

LEfSe 顯示了每組中豐度相對較高的物種（圖4A）。在門、綱、目、科、屬和種水平上具有顯著差異的微生物豐度如圖4B所示。在 RSGB 處理組的糞便中檢測到大量 RSGB 代謝物，包括三萜類、萜內(nèi)酯、萜苷、甾醇、黃酮類和環(huán)丁烷木脂素（圖4C）。相關(guān)性分析顯示，幾種RSGB代謝物與腸道微生物呈正相關(guān)，尤其是人參代謝物和乳酸桿菌（圖4D）。

圖4 |?人參固本（RSGB）對甲狀腺毒癥小鼠糞便微生物組的影響及微生物組與RSGB代謝物的相關(guān)性

a)LEfSe 顯示每組中豐度相對較高的物種。

b)在門、綱、目、科、屬和種水平上存在顯著差異的微生物豐度。

c)RSGB 治療小鼠糞便中的 RSGB 代謝物。

d)RSGB處理組糞便中微生物組與RSGB代謝物的相關(guān)性。

8.RSGB口服液的安全性

對RSGB口服液（20ml·kg?，W）治療30天的安全性進(jìn)行了研究。與正常對照小鼠（N）相比，RSGB單獨(dú)治療組的生化測試中僅發(fā)現(xiàn)TG和LDL-C降低。WBC、NEUT和LYMPH在血常規(guī)檢查中略有升高屬正常水平，為藥效作用的擴(kuò)展，其他指標(biāo)沒有差異，表明RSGB口服液長期給藥30天無毒性反應(yīng)，證明了RSGB口服液的安全性。

9.RSGB口服液和含藥血清中的活性成分

對植物代謝組學(xué)顯示，通過LC-MS/MS對RSGB口服液（R）和含藥血清（L）共鑒定和定量了121種植物成分（圖5A）。在藥物和含藥血清中含量較高的酚酸包括原兒茶酸、咖啡酸、異阿魏酸、水楊酸、香草酸、4-羥基苯甲醛和阿魏酸（圖5B）。在 RSGB 口服液和含藥血清中均檢測到黃芩苷和多種槲皮素衍生物（圖5C）。生物堿包括膽堿和多種核苷（圖5D）。單寧主要是鞣花酸、沒食子酸及其衍生物（圖5F）。有四種酚胺，N-阿魏酰尸胺、N-阿魏酰羥基腐胺、對香豆酰酪胺和N-阿魏酰酪胺（圖5G）。RSGB口服液和含藥血清中含有大量氨基酸和有機(jī)酸（圖5H，I）。含藥血清中杜仲醇和阿亞平的豐度相對較高（圖 5J）。這些物質(zhì)可能是RSGB口服液藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖5 | 人參固本（RSGB）口服液和含藥血清的成分

a)在RSGB口服液（R）和含藥血清（L）中共鑒定出121種植物成分，其中b)酚酸30種、c)黃酮類17種、d)生物堿16種、 e)萜類化合物14種、f)單寧12種、g)酚胺4種、h)氨基酸12種、i)有機(jī)酸9種、j)其他7種。

10.RSGB機(jī)制示意圖

如圖6所示. RSGB 治療通過上調(diào) Alb、Ttr 和功能蛋白顯著改善了甲狀腺毒癥小鼠的低蛋白血癥。上述功能蛋白的恢復(fù)不僅表明營養(yǎng)不良得到了改善，而且有利于維持防御能力。RSGB 治療通過降低脂毒性來改善免疫衰老。RSGB 通過降低脂毒性脂質(zhì)和脂質(zhì)樣分子（如游離脂肪酸、甘油三酯、鞘脂和糖皮質(zhì)激素）的水平來減輕脂毒性。此外，RSGB中眾多具有優(yōu)異抗氧化活性的活性成分具有直接的抗脂毒性作用。保護(hù)性類脂分子 DPA、維生素 D3 和膽汁酸水平的增加有助于提高防御能力，RSGB 還上調(diào)了乳酸菌。

圖6 |?RSGB作用機(jī)制

研究結(jié)論

隨著年齡的增長，機(jī)體的免疫功能逐漸下降，導(dǎo)致易患傳染病、腫瘤、自身免疫病和一些老年疾病。衰老除了免疫力外，還表現(xiàn)在生理、生化、新陳代謝、內(nèi)分泌、器官等各個(gè)方面，這些方面相互影響，所以衰老是一系列事件的疊加效應(yīng)。可以對這些事件做出反應(yīng)的衰老模型具有很大的科學(xué)意義，而對這些方面有影響的藥物將具有巨大的抗衰老潛力。作者之前的研究表明，甲狀腺毒癥小鼠模型就是這樣一種模型。在該模型中，生理方面全血細(xì)胞總數(shù)減少，生化方面TP和Alb降低，免疫方面免疫細(xì)胞數(shù)量和功能降低，補(bǔ)體水平降低。所有這些表現(xiàn)都與衰老和衰老相關(guān)疾病有關(guān)。本研究在甲狀腺毒癥小鼠模型上證實(shí)了中藥方劑RSGB的抗衰老作用，并對其抗衰老機(jī)制進(jìn)行了充分探索。

總體而言，RSGB從以下幾個(gè)方面改善了甲狀腺毒癥小鼠的衰老特征：增加免疫細(xì)胞數(shù)量和功能，提高免疫分子水平，降低脂毒性，改善營養(yǎng)狀況，調(diào)節(jié)腸道菌群。

本研究驗(yàn)證了RSGB對甲狀腺毒癥小鼠的抗衰老作用，并闡明了其作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)。除了通過測試血液指標(biāo)獲得的抗衰老效果外，鑒于RSGB成分的多重保護(hù)作用，推測RSGB可能還具有器官保護(hù)作用，接下來的研究將驗(yàn)證器官保護(hù)作用，以更充分地證明RSGB的抗衰老作用。長期以來，中醫(yī)藥多要素、多效的系統(tǒng)治療策略為保障國人健康發(fā)揮了重要作用，相信隨著對中醫(yī)藥的不斷研究和認(rèn)識，未來在保障全球人類健康方面也將發(fā)揮更大的作用。

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本研究采用常規(guī)檢測方法結(jié)合多組學(xué)技術(shù)，研究人參固本（RSGB）口服液對甲亢加速衰老小鼠模型的影響。對于血液和血清，文章采用了流式細(xì)胞確定免疫衰老表型，采用生化檢驗(yàn)和蛋白組學(xué)確定脂質(zhì)的代謝變化。采用植物代謝組學(xué)解析特有代謝產(chǎn)物。文章還利用關(guān)聯(lián)分析技術(shù)，挖掘和歸納作用機(jī)制。文章為中藥的現(xiàn)代化研究提供路線，為中藥的臨床應(yīng)用價(jià)值挖掘提供思路，值得借鑒和推廣。

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