DNA的細(xì)胞化學(xué)- -- Feulgen 反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解Feulgen反應(yīng)的原理，掌握有關(guān)的操作方法

實(shí)驗(yàn)原理

DNA是由許多單核背酸合成的多核苷酸，每個(gè)單核苷酸又由磷酸、脫氧核糖和堿基構(gòu)成=DNA經(jīng)1mol/L鹽酸水解，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的鍵打開(kāi)，使脫氧核糖的第-碳原子上形成游離的醛基，這些醛基與Schiff試劑反，生成紫紅色化合物。

實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑

顯微鏡，恒溫水浴鍋.溫度計(jì).解剖針.酒精燈.試管.燒杯、載玻片.蓋玻片、吸水紙洋蔥鱗莖或根尖

1mol/L鹽酸的配制:取82.5ml密度1.19g/ml的濃鹽酸加蒸餾水至1000ml

Schiff 試劑的配制及保存:稱取0.5g堿性晶紅加入到100ml煮沸的蒸餾水中(用三角燒瓶)，時(shí)時(shí)振蕩，繼續(xù)煮5min (勿使之沸騰) ， 使之充分溶解.然后冷卻至50°C時(shí)用濾紙過(guò)濾，濾液中加入10ml 1M HCI,冷卻至25°C時(shí)，加入0.5g Na2S2Os (偏重亞硫酸鈉)，充分振蕩后，窘緊瓶塞，在室溫暗處?kù)o置至少24h (有時(shí)需 2-3d) .使其顏色退至淡黃色，然后加入0.5個(gè)活性埃粒，用力振蕩1min.最后用粗濾紙過(guò)濾于棕色瓶中，封嚴(yán)瓶塞，外包黑紙。濾液應(yīng)為無(wú)色也無(wú)沉淀，貯于4"C冰箱中備用。如有白色沉淀，就不能再使用，如顏色變紅，可加入少許偏重亞硫酸鈉或鉀，便之再轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)色時(shí)，仍可再用.

亞硫酸水:取200ml自來(lái)水，加10ml 10%偏重亞硫酸鈉水溶液和10ml 1M HCI,三者使用前混勻。

方法與步驟:

1、將洋蔥根尖或鱗莖內(nèi)表皮放在1mol/L HC中，加熱到60°C水觶8-10min

2、蒸餾水水洗

3、Schiff試劑避光染色30min

4、用新鮮配制的亞硫酸水溶液洗3次，

每次1min

5、水洗5min

6.將根尖放在載玻片上，鑷子搗碎，蓋上蓋玻片，壓片.

7.顯微鏡檢查

對(duì)照片

方法一:先將材料放在5%三氣乙酸中90°C水浴15min,主要把DNA抽提掉，然后按步驟1-7制片觀察。

方法二:材料不經(jīng)水解，直接染色， 制片觀察。

RNA的細(xì)胞化學(xué)- Brachet反應(yīng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

了解Brachet反應(yīng)的原理，掌握有關(guān)的操作方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

甲基綠一派洛寧(methyl green-pyronin)為堿性染料,它能分別與細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA結(jié)合而呈現(xiàn)不同顏色。當(dāng)甲基綠與派洛寧作為混合染料時(shí)，甲基綠和染色質(zhì)中DNA選擇性結(jié)合顯示綠色或藍(lán)色:派洛寧與核仁、細(xì)胞質(zhì)中的RNA選擇結(jié)合顯示紅色其原因可能是兩種染料的混合染液中有競(jìng)爭(zhēng)作用，同時(shí)兩種核酸分子都是多聚體，而其聚合程度有所不同。甲基綠易與聚合程度高的DNA結(jié)合呈現(xiàn)綠色。而派洛寧則與聚合程度較低的RNA結(jié)合.呈現(xiàn)紅色，但解聚的DNA也能和派洛寧結(jié)合呈現(xiàn)紅色，即RNA對(duì)派洛寧親和力大，被染成紅色，而DNA對(duì)甲基綠親和力大,被染成藍(lán)綠色

三.實(shí)驗(yàn)材料

洋蔥鱗莖表皮

四、儀器和試劑

顯微鏡、冰箱、天平、量筒、表面皿、裁玻片、蓋玻片、探針.鑷子.洗瓶.吸水紙等。1、Unna試劑:甲基綠派洛寧染色液

甲液: 5%派洛寧水溶液6ml

2%甲基綠水溶液6ml

蒸餾水16ml

乙液: 1mol/L 乙酸緩沖液( pH4.8)16ml

甲乙兩液分別置4C冰箱備用，用時(shí)甲乙兩液混勻。

2. 1mol/L乙酸緩沖被(pH4.8) 配方:

A液:冰醋酸6m加蒸餾水至100ml

B液:乙酸鈉13.5g加蒸餾水 至100ml

取A液40ml+ B被60ml混勻即為pH=4.8

配制注意事項(xiàng):①Pyronin可加熱助溶。②Methyl green批號(hào)不同，染色效果差別很大。商品Methyl green常混有甲基紫，影響染色效果，應(yīng)先把藥品放在分液漏斗中，加入足量的氯仿，用力振蕩，然后靜置，直到洗脫甲基紫為止,最后干燥備用。

五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法

1.用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊，置于載玻片上。

2.滴一滴Unna試劑，染色30min 。

3.蒸餾水洗兩次，吸水紙吸去多余水分。

4.蓋上蓋玻片,鏡檢

對(duì)照片

1.撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，經(jīng)5%三氯乙酸90C水浴處理15min，再經(jīng)70%乙醇洗片刻，然后按步驟1- 4制片觀察.

2.撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，用0.1%RNA酶室溫處理10-15min "蒸餾水洗，吸干，然后按步驟1-4制片觀察。

六、實(shí)驗(yàn)作業(yè)及思考題

繪圖細(xì)胞中RNA和DNA的分布

七、補(bǔ)充資料

1.在植物花粉形成過(guò)程中，花藥內(nèi)的一些細(xì)胞分化成小孢子母細(xì)胞(2n) ，每個(gè)小孢子母細(xì)胞進(jìn)行二次連續(xù)的細(xì)胞分裂(第- -次減數(shù)分裂和第二次堿數(shù)分裂)

?每個(gè)小孢子母細(xì)胞產(chǎn)生四個(gè)子細(xì)胞，每個(gè)子細(xì)胞就是一個(gè)小孢子。小孢子內(nèi)的染色體數(shù)目是體細(xì)胞的一半。

2.在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)采集植物的花蕾，經(jīng)固定. 染色、壓片后，就可以在顯微鏡下觀察到細(xì)胞的減數(shù)分裂。整個(gè)過(guò)程可分為下列各個(gè)時(shí)期:

(1) 間期: DNA復(fù)制

(2)第一次減數(shù)分裂(RDI)

前期II:染色質(zhì)濃縮卷曲成染色體狀態(tài)，核仁、核膜消失。

中期II:染色體排列在赤道板上，每個(gè)染色體含有一個(gè)著絲粒.兩條染色單體。兩條染色單體開(kāi)始分離。此時(shí)細(xì)胞的染色體數(shù)為n.每個(gè)染色體有兩條染色單體

后期I:著絲粒一分為二，姊妹染色單體分離，向兩極移動(dòng).

末期II:染色體解螺旋變?yōu)槿旧|(zhì)狀態(tài)，核仁.核膜重現(xiàn)，胞質(zhì)分裂，各形成兩個(gè)子細(xì)胞.

3.實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵:供試材料大想花序的準(zhǔn)備及處理方法，待早春3-4月大蔥花序長(zhǎng)到顏色呈綠色時(shí)，直接采摘花序后放在卡諾液中固定24小時(shí)，再放入95%、80%酒精依次脫水，最后換70%酒精放在冰箱4°C長(zhǎng)期保存，取材時(shí)期是影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。