微生物在人體多個(gè)身體部位與宿主共生，構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的多王國(guó)群落。宿主-微生物組的相互作用不僅維持著機(jī)體的多種生理狀態(tài)平衡，而且正常的菌群在一些條件下還會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【鷱亩鴮?dǎo)致疾病的發(fā)生。腫瘤組織中的非惡性細(xì)胞包圍著惡性細(xì)胞構(gòu)成復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，微環(huán)境中細(xì)胞類型的組成和豐度不同可能具有促癌或抑癌作用。已有的研究報(bào)道表明，至少 33 種主要癌癥存在腫瘤內(nèi)微生物群，且微生物可以存在于細(xì)胞內(nèi)[1]。動(dòng)物模型研究也表明，腫瘤相關(guān)微生物群中的細(xì)菌在癌癥發(fā)展、轉(zhuǎn)移、免疫監(jiān)測(cè)和化學(xué)耐藥性等方面發(fā)揮作用。然而腫瘤內(nèi)微生物的確切身份、腫瘤內(nèi)微生物群的空間分布，以及微生物與患者腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞的相互作用尚未被完全揭示，后續(xù)癌癥發(fā)生、診療研究中加強(qiáng)對(duì)微生物組的分析和理解具有重大的科學(xué)意義及臨床意義[2]。

2022年10月?Cancer Cell?上發(fā)表的題為 Tumor microbiome links cellular programs and immunity in pancreatic cancer 的腫瘤微生物研究，此文章基于單細(xì)胞技術(shù)開(kāi)發(fā)了 SAHMI 算法來(lái)評(píng)估宿主-微生物組之間的相互作用，揭示了胰腺癌中腫瘤細(xì)胞中存在的特異性的微生物，這部分微生物與細(xì)胞類型間基因的差異表達(dá)、以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和免疫信號(hào)傳導(dǎo)等功能密切有關(guān)[3]。如圖 1 所示，SAHMI 讀取單細(xì)胞 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)的 Reads，采用基于 K-mer 的 Kraken2Uniq 軟件進(jìn)行宿主和微生物參考基因組進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合噪音數(shù)據(jù)與真實(shí)微生物比對(duì)結(jié)果間 Kmer 相關(guān)性分布的不同，以及單細(xì)胞中真實(shí)包含微生物與不包含微生物的陰性對(duì)照間的 Kmer 分位數(shù)分布差異，實(shí)現(xiàn)從初步比對(duì)鑒定結(jié)果中識(shí)別并去除噪音污染，保留高可信度的微生物比對(duì)鑒定結(jié)果。

雖然 SAHMI 對(duì)微生物鑒定的準(zhǔn)確性在方法學(xué)上進(jìn)行了優(yōu)化，但是博奧晶典生信團(tuán)隊(duì)通過(guò)實(shí)際數(shù)據(jù)測(cè)試，發(fā)現(xiàn)依然存在假陽(yáng)性的比對(duì)結(jié)果，且運(yùn)算時(shí)間長(zhǎng)，最重要的是沒(méi)進(jìn)行 Barcode 矯正，這將直接影響到微生物與單細(xì)胞對(duì)應(yīng)關(guān)系的準(zhǔn)確性，也會(huì)間接影響到微生物與細(xì)胞類型互作的研究可靠性。據(jù)此，我們的生信團(tuán)隊(duì)對(duì) SAHMI 做了改進(jìn)，采用 CellRanger 實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞 Barcode 的矯正，選取未比對(duì)到宿主的序列進(jìn)行后續(xù)微生物比對(duì)分析，增加了 K-mer 分類算法的置信度 confidence ，而且使運(yùn)行時(shí)間大大減少，單細(xì)胞微生物鑒定的準(zhǔn)確性和效率均明顯提高。

單細(xì)胞測(cè)序微生物檢測(cè)總體分析結(jié)果如圖2所示，橫坐標(biāo)是鑒定全部微生物對(duì)應(yīng)的不同的屬水平，縱坐標(biāo)（左）對(duì)應(yīng)柱狀圖的高低，表示全部單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)中比對(duì)到此微生物屬的總 Reads 數(shù)，縱坐標(biāo)（右）累積曲線表示累積的百分比，整個(gè)圖從左至右，排在第一位的類芽孢桿菌 Reads 的比例占到了全部 Reads 的 64%，與第二位的支原體累加到一起占全部微生物 Reads 的 90%。

具體到每個(gè)細(xì)胞中是否檢測(cè)到微生物的分析結(jié)果見(jiàn)圖3，該圖展示了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的 tSNE 分布，圖中紅色的細(xì)胞表示檢測(cè)到了微生物，藍(lán)色的細(xì)胞表示沒(méi)有檢測(cè)到微生物，可以看出微生物相關(guān)細(xì)胞的分布情況。后續(xù)也可結(jié)合細(xì)胞類型注釋的結(jié)果，分別統(tǒng)計(jì)每種細(xì)胞類型下包含微生物的細(xì)胞的比例等信息。

本文介紹了 SAHMI 在單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)中微生物檢測(cè)的應(yīng)用，及博奧晶典生信團(tuán)隊(duì)對(duì) SAHMI 算法的改進(jìn)，提示了微生物組檢測(cè)在腫瘤研究中的新應(yīng)用方向，但并非說(shuō)單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的微生物檢測(cè)只能應(yīng)用于腫瘤組織樣本，其同樣適用于感染類傳染病如 HBV、COVID-19 等患者的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的微生物檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Galeano Ni?o JL, Wu H, LaCourse KD, Kempchinsky AG, Baryiames A, Barber B, Futran N, Houlton J, Sather C, Sicinska E, Taylor A, Minot SS, Johnston CD, Bullman S. Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer.?Nature. 2022 Nov;611(7937):810-817.[2] Cullin N, Azevedo Antunes C, Straussman R, Stein-Thoeringer CK, Elinav E. Microbiome and cancer.?Cancer Cell. 2021 Oct 11;39(10):1317-1341.[3] Ghaddar B, Biswas A, Harris C, Omary MB, Carpizo DR, Blaser MJ, De S. Tumor microbiome links cellular programs and immunity in pancreatic cancer.?Cancer Cell. 2022 Oct 10;40(10):1240-1253.e5.