為了了解和再現(xiàn)肝細胞在其生理微環(huán)境中的細胞相互作用并生成人工3D體外模型，開發(fā)了一種使用3D擠出生物打印的共培養(yǎng)系統(tǒng)?；谠逅猁}和甲基纖維素 (algMC) 的生物墨水首次被證明適用于肝細胞的生物打??；向algMC添加Matrigel可增強它們在單相支架中的增殖和形態(tài)。為了研究更復雜的細胞相互作用系統(tǒng)，我們應用核殼生物打印技術為肝細胞建立定制的3D共培養(yǎng)模型。

研究目的

建立基于3D核殼生物打印的概念，以algMC為基礎生物墨水，在每個階段提供穩(wěn)定的核殼隔層支持被囊細胞的肝臟模型的生物構建。以HepG2(一種癌源性永生肝細胞系)為模型系統(tǒng)，我們開發(fā)了一種優(yōu)化的墨水，以便更好地概括它們各自的生化微環(huán)境，從而支持細胞功能。這是通過將我們之前開發(fā)的algMC blend18與Matrigel進行功能化實現(xiàn)的。評估了所開發(fā)的墨水和核殼打印與HepG2細胞相結合的3D肝臟模型的適用性。作為組織復雜性方向的進一步發(fā)展，通過使用同軸擠壓建立了成纖維細胞-HepG2共培養(yǎng)系統(tǒng)。在對打印的核殼構建物培養(yǎng)數(shù)周后，通過評估細胞形態(tài)和分布以及相關生物標志蛋白的表達來研究細胞與細胞之間的相互作用，以評估所開發(fā)的3D模型是否適合研究微環(huán)境對肝細胞的表型和性能的影響。

研究所用打印機及耗材

在無菌條件下使用GeSiM公司的BioScaffolder 3.1型號生物3D打印機制作支架。使用壓縮空氣通過錐形給藥針(Nordson EFD, Germany)分配糊狀生物墨水;在12個以空氣為繪圖介質(zhì)的井板中，股線以一層一層的方式沉積，每層平行排列，層間方向偏移90°。

研究過程

HepG2在使用和不使用Matrigel的algMC打印結構中的活性
為了研究封裝的HepG2的活性，生物打印和交聯(lián)構建物培養(yǎng)了至少10天。在培養(yǎng)的不同時間點，用Calcein AM和EthD-1同時對支架內(nèi)的活細胞和死細胞進行染色。

圖1：使用和不使用Matrigel時，HepG2嵌入algMC的活力。(A)培養(yǎng)第2天、第7天和第10天嵌入打印支架的HepG2活/死染色的cLSM圖像?；罴毎蝗境删G色(鈣黃素)，而死細胞被染成紅色(同型二聚體-1);比例尺= 250μm。(B)兩種條件的存活率(存活集群與總集群的體積比)比較(n = 6，平均值±SD， ****p < 0.0001)。

使用和不使用Matrigel的algMC打印結構中HepG2的形態(tài)和組織

為了觀察生物打印水凝膠支架內(nèi)細胞的形態(tài)和組織，在培養(yǎng)的不同時間點對肌動蛋白細胞骨架和細胞核進行染色。

圖2：培養(yǎng)2、7和10天后，HepG2嵌入有(上)和無基質(zhì)(下)的algMC的形態(tài)和組織。細胞核染色為藍色(DAPI)，細胞骨架顯示為綠色(Phalloidin-iFluor 488染色肌動蛋白);比例尺代表50μm。

核殼生物打印系統(tǒng)中肝細胞-成纖維細胞間接共培養(yǎng)的空間定義模式

在確定合適的水凝膠材料支持肝細胞在3D環(huán)境下生長和功能后，我們旨在研究它們在由核殼三維生物圖譜制作的復雜共培養(yǎng)系統(tǒng)中的性能。

圖3：肝細胞-成纖維細胞共培養(yǎng)概念的圖示，顯示被包裹在外殼中的肝細胞與核心的NIH 3T3成纖維細胞同軸打印，兩者在各自的生物墨水中作為單細胞共打印(左)。假設核心成分(含或不含成纖維細胞和基質(zhì)成分)對肝細胞表型的影響，因為它們可能在殼室中生長成簇，成纖維細胞在培養(yǎng)期間擴散形成網(wǎng)絡( 右)。使用Biorender.com軟件創(chuàng)建的圖像。

制造載有細胞的核殼鏈支架

采用出口直徑為800μm(殼)和400μm(芯)的同軸針制造核殼鏈。

圖4：殼層用800μm針繪制，芯層用400μm針繪制。(A)無細胞的核殼鏈的立體顯微圖像，呈曲流狀沉積，鏈內(nèi)核(algMC)和殼(algMC+ Matrigel)分隔清晰;(B)無細胞的打印支架的立體顯微圖像，核心處有藍色染色，用于通過同軸鏈可視化連續(xù)的核心室;插入物顯示通過鋼絞線段的截面，從腳手架刻度條上切割出2毫米。

圖5：培養(yǎng)第7天的代謝活性(通過MTT染色;紫色)的HepG2和NIH 3T3細胞嵌入核殼打印水凝膠支架;核-殼界面通過c中的白色虛線可見，上面的圖顯示HepG2被包裹在由algMC+Matrigel組成的殼室中，而核仍然是游離細胞。下圖顯示NIH 3T3細胞被包裹在由algMC組成的核心腔室中，而外殼仍然沒有細胞。(A,B)比例尺2 mm。(C)比例尺500μm。

在核殼鏈支架中同時嵌入 HepG2 和 NIH 3T3 細胞

為了在同時進行生物打印后對兩種細胞類型進行可視化，首先用預先標記的細胞進行共培養(yǎng)實驗。DiD標記的肝細胞（紅色）被包裹在由algMC+Matrigel組成的外殼中，而DiI標記的成纖維細胞（藍色）被包裹在由algMC組成的核心中。然后將這些支架與單一培養(yǎng)支架進行比較，后者只在外殼中有did標記的肝細胞，核心中沒有細胞。

圖6：核殼鏈支架中HepG2和NIH 3T3的空間分布。(A,B)支架中條帶的熒光圖像顯示HepG2/NIH 3T3共培養(yǎng)與HepG2單培養(yǎng)支架中被包被細胞的分布;比例尺200μm。白色虛線表示整個鏈的寬度。(C)培養(yǎng)第4天核殼鏈共培養(yǎng)支架的熒光圖像顯示綠色的鈣黃素染色活細胞;為了顯示核心，覆蓋青色通道(dii標記的NIH 3T3);比例尺1000μm。

圖7：HepG2與NIH 3T3共培養(yǎng)及在核殼鏈支架中單獨培養(yǎng)的活性及定位。共聚焦圖像顯示，已標記的HepG2(紅色)被包裹在由algMC+基質(zhì)組成的殼室中，NIH 3T3成纖維細胞被包裹在algMC核中，并用DiI(青色)標記(上圖)或無細胞的algMC核(下圖)?；罴毎?Calcein-AM（綠色）染色。圖顯示了肝細胞在培養(yǎng)期間細胞簇形成的進展。比例尺(第1天)500μm;比例尺(第7、14天)300μm;白色虛線在這里表示核-殼接口。

核心生物墨水的功能化--增強成纖維細胞網(wǎng)絡的形成

由于我們假設成纖維細胞的表型直接影響與肝細胞的相互作用，下一步是研究功能化生物墨水對NIH 3T3表型的影響。

圖8：共培養(yǎng)第7天，成纖維細胞在核心室形成網(wǎng)絡。核-殼水凝膠鏈共聚焦圖像，在algMC+基質(zhì)殼中包裹有did標記的HepG2(紅色)，在algMC核中嵌有dii標記的NIH 3T3成纖維細胞(青色)，algMC補充了纖維蛋白，algMC補充了血漿。活細胞被Calcein AM染成綠色，表明纖維蛋白和血漿功能化核心內(nèi)形成了成纖維細胞網(wǎng)絡，而未修飾的algMC核心中保持成纖維細胞的圓形形態(tài)。上面的瓦片給出了核殼鏈的一個部分的概述;放大倍率5倍，比例尺500μm。下圖顯示核心的NIH 3T3成纖維細胞放大倍數(shù)(10倍)圖像;比例尺400μm。

微環(huán)境對核殼生物打印共培養(yǎng)系統(tǒng)中肝臟標記蛋白表達的影響

肝細胞的功能通常通過其合成和分泌特定蛋白質(zhì)的能力來評估。因此，為了研究在不同核心材料中生長的成纖維細胞對鄰近殼室肝細胞的影響，我們通過抗體染色和隨后的免疫熒光顯微鏡觀察不同條件下特異性標記蛋白的表達。

圖9：單核細胞培養(yǎng)中(無細胞的algMC核;I)和NIH 3T3成纖維細胞共培養(yǎng)嵌入不同成分的核心室(II-IV)。(A) HepG2蛋白(紫色)、細胞核(藍色)和細胞骨架(綠色)染色共聚焦圖像;比例尺50μm。(B) HepG2的CK-19(黃色)、細胞核(藍色)和細胞骨架(紅色)染色共聚焦圖像;比例尺50μm。(C) HepG2的AAT(綠色)、細胞核(藍色)和細胞骨架(紅色)染色共聚焦圖像;比例尺50μm。

開發(fā)的水凝膠系統(tǒng)的流變學和機械性能

為了進一步表征改性水凝膠共混物的打印后和交聯(lián)性能，我們對單相支架進行了單軸壓縮試驗，以研究三維結構在繪圖和后處理后的機械穩(wěn)定性和剛度。

圖10：打印和交聯(lián)后單相和核殼鏈支架的機械特性。( A )交聯(lián)單相支架在第1天的應力-應變曲線。( B ) 交聯(lián)的單氣態(tài)腳手架在第1天的壓縮模量。( C ) 交聯(lián)的核殼支架在第1天時的應力-應變曲線，其核心成分algMC+Matrigel 殼中是不同的。( D ) 交聯(lián)核殼支架在第1天的壓縮模量（n = 4，p*** < 0.0005，平均值±SD）。

為了構建肝組織模型，以核-殼方式共培養(yǎng)成纖維細胞是了解這種共培養(yǎng)生物打印策略的巨大潛力的第一步。為了開發(fā)體外肝臟模型，開發(fā)與其他細胞類型的共培養(yǎng)系統(tǒng)將是我們未來工作的目標，在此演示如何使用核-殼技術使我們能夠為生物打印細胞設計定制的3D微環(huán)境。為了模擬由血管和相互連接的血管組成的生理肝臟結構，下一步將進一步增加開發(fā)用于肝細胞與內(nèi)皮細胞和其他支持細胞類型共培養(yǎng)的打印結構的復雜性。這將使我們能夠研究這些3D系統(tǒng)中的細胞相互作用，并建立可灌注的肝臟模型。

圖11：肝細胞共培養(yǎng)概念的圖形表示，顯示了體內(nèi)的肝小葉是如何由血管、導管和管道（脈管）組成的，如上圖所示，這些血管、導管和管道被肝細胞片所包圍。因此，模擬肝小葉微結構的概念被設想為打印在外殼上的肝細胞和排列在可灌注結構核心的內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng)模型(下圖)。中間插圖來自 Cornell, B. 2016。肝小葉。

研究結論

研究中我們提出了基于3D擠壓的生物打印作為一種有前途的工具來生成具有生物活性的肝組織模型。通過對生物墨水成分的特定適應，以及以核殼方式應用兩種不同生物墨水的同軸打印，可以控制和調(diào)節(jié)肝細胞的3D微環(huán)境，以模擬特定的條件。我們采用核殼鏈/支架設計，建立了肝細胞和成纖維細胞的功能共培養(yǎng)模型。通過比較不同的墨水成分(含或不含生物活性成分的algMC)以及共培養(yǎng)與單培養(yǎng)，我們可以在我們的概念驗證研究中展示空間定義的3D微環(huán)境的變化成分對肝細胞增殖和所選肝細胞特異性標記物表達水平的強烈影響。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了定制3D微環(huán)境以生成人工肝臟結構的重要性，以及為此目的的多功能生物打印技術的巨大潛力。論文全文可以聯(lián)系上海錦廷科技獲取，謝謝