細胞凋亡(Apoptosis)?是生物界廣泛存在的一種現(xiàn)象，與其它的生命現(xiàn)象一樣具有同等重要的生理學或病理學意義。盡管其最終結果也是導致細胞死亡，但其誘導因素、發(fā)生機制和過程及意義均明顯不同于一般的病理性細胞死亡(即細胞壞死性死亡，簡稱細胞死亡)?。細胞凋亡的形態(tài)特征與細胞壞死性死亡的形態(tài)特征不同。細胞壞死性死亡是被動的病理性死亡，其形態(tài)特征首先是膜通透性增加，細胞外型發(fā)生不規(guī)則變化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，核染色質(zhì)不規(guī)則移位，進而線粒體及核腫張，溶酶體破壞，細胞膜破裂，胞漿外溢，這種死亡過程常常引起炎癥反應。細胞凋亡則是在某些因素的誘導下，由細胞內(nèi)在的有規(guī)律的機制引起的，是主動的生理性細胞自殺。其特征是細胞首先變圓，隨即與鄰近細胞脫離，失去微絨毛，胞漿濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張呈泡狀并與細胞膜融合，線粒體無明顯變化，核染色質(zhì)濃縮成塊并凝聚在核膜周邊，胞膜內(nèi)陷將細胞自行分割為多個有外膜包裹、內(nèi)涵物不外溢的凋亡小體，后被吞噬細胞或鄰周細胞所識別、吞噬。由于細胞凋亡過程不導致溶酶體破壞及胞膜破裂，沒有細胞內(nèi)容物外泄，故不引起炎癥反應，在生理條件下，生物體內(nèi)細胞存活與死亡是由自身發(fā)育階段提供的遺傳信息，或由鄰近細胞和其微環(huán)境提供的信號決定的，其中包括細胞相互接觸提供的信號以及周圍環(huán)境中活性物質(zhì)、激素等。

細胞壞死是極端的物理、化學因素或嚴重的病理性刺激引起的細胞損傷和死亡，是非正常死亡。長期以來細胞壞死被認為是因病理而產(chǎn)生的被動死亡，但是近期的研究表明，細胞壞死可能是細胞“程序性死亡”的另一種形式，具有包括引發(fā)炎癥反應在內(nèi)的重要生理功能。當細胞凋亡不能正常發(fā)生而細胞必須死亡時，壞死作為凋亡的“替補”方式被采用。

細胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹常用的形態(tài)學檢測方法。

1.光學顯微鏡和倒置顯微鏡

凋亡細胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊，有時可碎裂。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細胞常以分散單個形式存在，凋亡細胞與周圍細胞分離，不引起炎癥反應。

本方法簡便易行，但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標，具有較強的主觀性，重復性差。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察，作為分析指標之一。

（1）未染色細胞：

凋亡細胞的體積變小、變形，全面皺縮，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體，凋亡小體為數(shù)個圓形小體圍繞在細胞周圍。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

（2）染色細胞：

姬姆薩（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常細胞核色澤均一；凋亡細胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)；壞死細胞染色淺或沒染上顏色。

蘇木素-伊紅（HE）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細胞），正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失。

2.熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。三種染料與DNA 的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。??PI和Hoechst33342雙標：PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結合。但DAPI不能通過正常細胞膜，Hoechst則為膜通透性熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。正常細胞和中早期調(diào)亡細胞均可被Hoechst著色，但是正常細胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故PI著色為壞死細胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細胞。凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

3.電子顯微鏡雖然光學顯微鏡下可以看見胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細胞的形態(tài)學變化大多發(fā)生在超微結構,因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細胞結構在凋亡不同時期的變化。電鏡形態(tài)學觀察是迄今為止判斷凋亡最經(jīng)典、最可靠的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準。檢測方法：透射電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。結果評判:可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象。缺點：1）只能定性,不能定量;2）標本處理過程復雜,設備相對昂貴,對檢查者的技術水平要求較高,不適于大批標本檢測;3）在組織切片上進行電鏡觀察時,有時凋亡很難與正常細胞有絲分裂相鑒別,因為兩種情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚。如同時進行熒光染色,可彌補電鏡檢查的不足。4.流式細胞技術流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時行的。細胞穿過流式細胞儀的激光束集點時使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細胞大小及結構的信息。由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數(shù)的檢測結合起來才能準確地辨認凋亡細胞。細胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞。細胞凋亡的形態(tài)學檢測結果直觀,至今仍是判定細胞是否發(fā)生凋亡的金標準,但觀察凋亡細胞的形態(tài)特征耗時費力,不適于大量凋亡樣本的檢測。

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