選修三

發(fā)酵工程

消毒?滅菌（高溫滅菌）

配置 調(diào)ph?滅菌 倒平板（固體培養(yǎng)基） 接種 分離 培養(yǎng)

平板劃線法 稀釋涂布平板法（計(jì)數(shù)）

倒平板 防止冷凝水滴落產(chǎn)生污染

每一次劃線前后灼燒接種環(huán)

尿素分解菌取樣 十倍稀釋 無菌水 30-37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 統(tǒng)計(jì)比實(shí)際少 顯微計(jì)數(shù)法（血細(xì)胞計(jì)數(shù)法） 以尿素為唯一氮源

剛果紅和纖維素 透明圈篩選 尿素周圍酚紅

細(xì)胞工程

全能性

植物組織培養(yǎng)

外植體（只能消毒不能滅菌）（先用酒精再用次氯酸鈉，每次都要用無菌水清洗）-脫分化-愈傷組織-再分化-胚狀體-芽根-個體

生長素（根）比細(xì)胞分裂素（芽）

植物體細(xì)胞雜交?

先用纖維素和果膠酶去除細(xì)胞壁 獲得原生質(zhì)體

融合方法：電融合法 離心法 聚乙二醇 獲得雜種細(xì)胞-愈傷組織

意義：打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種

植物細(xì)胞工程應(yīng)用

1、快速繁殖（高效、快速實(shí)現(xiàn)大量繁殖 保持優(yōu)良品種的遺傳特性（無性生殖））

2、作物脫毒（病毒）取莖尖

3、單倍體育種 花藥離體培養(yǎng) 生殖細(xì)胞全能性 秋水仙素染色體加倍 極大縮短育種年限

4、突變體的利用

動物細(xì)胞工程

動物細(xì)胞培養(yǎng)?

添加血清 定期更換培養(yǎng)液 co2維持培養(yǎng)液的ph

用胰蛋白酶和膠原蛋白酶制成細(xì)胞懸液（一種懸浮生長 一種貼壁生長（接觸抑制））

原代培養(yǎng) 分瓶 傳代培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)直接離心法 貼壁重新用胰蛋白酶處理再用離心

干細(xì)胞培養(yǎng)

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 不會發(fā)生免疫排斥

動物細(xì)胞融合技術(shù)

滅活病毒誘導(dǎo)法 peg融合法

單克隆抗體（利用了動物細(xì)胞融合技術(shù)、動物細(xì)胞培養(yǎng)）

用特定的抗原對小鼠免疫 脾中產(chǎn)生特定抗體的b淋巴細(xì)胞 與骨髓瘤細(xì)胞融合 用選擇培養(yǎng)基篩選 獲得雜交瘤細(xì)胞（大量增殖 產(chǎn)生抗體）抗體檢測篩選（與特定抗原）小鼠腹水

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高 與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合 大量制備

動物細(xì)胞核移植

胚胎移植比體細(xì)胞方便

卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)到減二中期 將供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞

胚胎工程

精子獲能

兩個極體 作為受精標(biāo)志

桑葚胚 囊胚（滋養(yǎng)層）

胚胎移植（同種）

子宮不會發(fā)生免疫排斥 同期發(fā)情處理（使生理狀態(tài)相同）供體超數(shù)排卵處理（促性腺激素）

優(yōu)勢：充分發(fā)揮雌性優(yōu)良個體的繁殖潛力

胚胎分割（無性繁殖）

取滋養(yǎng)層做dna分析鑒定性別

基因工程

限制酶（限制性內(nèi)切核酸酶）識別雙鏈特定 切磷酸二酯鍵

Dna連接酶 兩個dna片段

載體 質(zhì)粒（具有自我復(fù)制能力）上有復(fù)制原點(diǎn)、目的基因、標(biāo)記基因

Dna不溶于酒精 能溶于2mol/L的NaCl溶液 沸水浴遇二苯胺試劑變藍(lán)色

一、目的基因的篩選和獲取

獲取目的基因：人工合成、PCR、構(gòu)建基因文庫

?????????????PCR原理：DNA的半保留復(fù)制（不可以擴(kuò)增mRNA）mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA

????????????????變性90以上 復(fù)性50左右 延伸72左右

二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

目的基因 標(biāo)記基因 啟動子（RNA聚合酶識別和聚合的部位） 終止子

限制酶切割位點(diǎn)位于啟動子和終止子中間

兩種限制酶切割避免自身環(huán)化反向連接

三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法（用ca離子處理獲得感受態(tài)) 轉(zhuǎn)化是指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)

四、目的基因的檢測與鑒定

PCR、核酸分子雜交（探針）

表達(dá)：抗原-抗體雜交